[发明专利]一种产β‑半乳糖苷酶的克雷伯氏菌及其应用

说明书

技术领域

发明涉及一种产β-半乳糖苷酶的克雷伯氏菌及其应用，属于微生物分离、培养技术领域。

技术背景

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），全名为β-D-半乳糖水解酶（β-D-galactoside galcagalcato-hydrolase，EC.3.2.1.23），简称乳糖酶。β-半乳糖苷酶的应用很广泛，在食品加工、医药、免疫、环境监测中均有体现，但以在食品中的应用为主。一方面，它可以应用到乳制品生产中，水解乳糖，提高乳制品甜度、改善风味，降低乳制品中乳糖含量，进而适应乳糖不耐症患者的需求；由于乳糖在低温下溶解性较差，因此当乳糖含量降低时，可以有效防止乳制品冷冻时出现结晶，改善口感等。另一方面，酶的受体为乳糖或者半乳糖等时，可通过转糖苷反应生成低聚半乳糖；低聚半乳糖是一种新型功能性糖，它可以促进益生菌的生长繁殖，提高机体免疫力，同时又具有低能量、低甜度等功能特性。

β-半乳糖苷酶来源非常丰富，广泛存在于植物、微生物、及动物肠道中。但目前用于工业生产的β-半乳糖苷酶仅来源于微生物；其中，细菌、酵母、霉菌均存在多种产β-半乳糖苷酶的菌种；而不同微生物来源的β-半乳糖苷酶的水解活性和转糖苷活性的比例不同。某些微生物，如黑曲霉、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母等所产生的β-半乳糖苷酶具有较强的水解活性；而保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和米曲霉等所产生的β-半乳糖苷酶则具有较强的转糖苷活性。但是，目前的天然产酶菌株的所产β-半乳糖苷酶的酶活普遍较低，优良天然菌株资源匮乏，因此筛选新型高产酶优良菌株具有主要意义。

发明内容

针对目前的天然产酶菌株所产β-半乳糖苷酶的的酶活普遍较低，优良天然菌株资源匮乏的现状，本发明的目的在于提供一种可产β-半乳糖苷酶的菌株。

本发明还提供了上述可产β-半乳糖苷酶的菌株的应用及其通过发酵获得β-半乳糖苷酶的方法。

技术方案

本发明从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株，命名为B5582Y；该菌株B5582Y，于37℃在筛选平板培养基平板培养24h，菌落呈圆形，直径2-5mm，中间凸起，表面光滑、粘稠，不易挑取；经革兰氏染色后呈红色，显微镜观察为革兰氏阴性菌短杆菌，无芽孢生成。所述筛选培养基：乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、琼脂20g/L、水余量，pH为7.0。

对本发明的菌株B5582Y进行BIOLOG GEN III生理生化试验，其生理生化特征与克雷伯氏菌相吻合。

对本发明的菌株B5582Y进行16s基因测序，序列SEQ ID NO.3所示。将所得菌株序列通过Genebank序列比对，利用MEGA6建立系统发育树，结果见图1。通过16S rDNA序列系统发育分析，菌株B5582Y鉴定为：克雷伯氏菌，Klebsiella michiganensis。

本发明的克雷伯氏菌（Klebsiella michiganensis）B5582Y，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号：CGMCCNo.13035，保藏日期为2016年9月23日。

本发明的克雷伯氏菌B5582Y，能够产β-半乳糖苷酶；所产β-半乳糖苷酶为胞内酶；所产β-半乳糖苷酶具有水解和转糖苷两种活性。

本发明的克雷伯氏菌B5582Y，产β-半乳糖苷酶的能力较强；通过摇瓶发酵10-24h，即可获得水解酶活为12U/mL的发酵液。

本发明的克雷伯氏菌B5582Y，连续传代10代以上，产β-半乳糖苷酶能力不变。

因此，与现有的能产生β-半乳糖苷酶菌株相比，本发明的克雷伯氏菌的特殊之处在于菌株较为新颖，所产β-半乳糖苷酶具有水解和转糖苷两种活性，产β-半乳糖苷酶的能力较强，遗传稳定性好。

本发明还提供了克雷伯氏菌B5582Y的应用，产生β-半乳糖苷酶。

一种采用克雷伯氏菌B5582Y产β-半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤：

发酵培养：将克雷伯氏菌B5582Y接种到发酵培养基，于转速160-200r/min、37℃的条件下恒温培养10h-24h，即可获得含有β-半乳糖苷酶的发酵液；

所述发酵培养基：乳糖10-40g/L、硫酸铵0-10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉0-10g/L、NaCl4g/L、水余量，pH为7.0。