[发明专利]一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法

说明书

本发明公开了一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，用纯化的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，再与Alexa Fluor488标记的以及Alexa Fluor594标记的GFAP抗体结合，形成抗体‑抗原‑两个荧光标抗体复合物，利用FRET原理用荧光酶标仪测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)浓度。由于用到了三个抗体同时识别，特异性更高，准确性更好，并比现有方法检测时间大大缩短。为临床诊断提供了参考信息，有助于临床医生诊断和评估脑卒中进展情况，改善病人的预后。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于荧光能量共振转移法（FRET）的GFAP检测方法。

背景技术

流行病学调查研究表明，目前脑血管疾病与心脏病、恶性肿瘤构成人类疾病死亡的三大原因。与西方发达国家相比，我国脑血管病的发病率和死亡率明显高于心血管病。据估算，全国每年新发脑卒中患者约为200万人；每年死于脑卒中的患者约150万人；存活患者人数600万～700万；且70％～80％的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重负担。其中，脑出血是一种致死率和致残率均高的常见病、多发病，严重危害人类特别是老年人的健康，威胁病人的生命，严重影响病人生活质量。

胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是一种分子量为50～52KDa的酸性蛋白，属细胞骨骼蛋白，是星形细胞胞质内的特异性蛋白，标志蛋白。GFAP在星形胶质细胞受到刺激引起反应时，其表达发生变化，在星形细胞中有丰富的、唯一的表达。研究发现GFAP和痴呆、多发性硬化及脑卒中有明显相关性。脑出血后神经元和神经胶质细胞受到损害，大量的胞浆蛋白质漏出细胞进入细胞间液，可溶性的GFAP通过细胞间液进入脑脊液，穿过破坏的血脑屏障进入血液循环。有研究表明脑出血患者发病6小时内血清GFAP水平即明显升高，而缺血性脑卒中患者6小时内血清GFAP水平与正常对照组无明显差异，因此认为GFAP是急性脑出血的生物学标志物。此外，还有研究表明，急性脑出血患者血清中的GFAP与脑出血体积之间有着密切的正相关关系，因此可以通过脑出血患者血清GFAP水平来判断患者的病情和预后。

目前，临床诊断上对GFAP的检测主要是ELISA实验方法，该方法因其特异性、灵敏度高而在近二十年来被广泛应用，但该方法步骤繁琐，所需检验时间较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，该方法特异性高，准确性好，检测用时短，操作方便。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，包括以下步骤：

1）采集待检测全血样品的血清；

2）用纯化的神经胶质纤维酸性蛋白抗体包被微孔板，制成固相抗体；

3）向包被抗体的微孔中加入神经胶质纤维酸性蛋白，然后再与Alexa Fluor488以及Alexa Fluor594标记的神经胶质纤维酸性蛋白抗体结合，形成抗体-抗原-两个荧光标记抗体复合物；

4）利用荧光能量共振转移法，用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算出待检测全血样品中神经胶质纤维酸性蛋白浓度。

步骤1）中，采集血清具体操作为：将全血样品于室温下放置2h或4℃过夜后，于1000×g离心20min，取上清既得到血清。

步骤2）中，是将抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体按1:200倍进行稀释，然后每孔加入100μl，于4℃过夜包被，制得固相抗体。