[发明专利]一种基于便携式血糖仪检测凝血酶的纸分析器件的构建

说明书

本发明公开了一种基于便携式血糖仪检测凝血酶的纸分析器件的构建。在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案；在纸芯片亲水工作区域生长金纳米粒子，负载含有凝血酶适配体链的发卡形结构探针，捕获目标物；蔗糖酶标记的识别链和发卡结构打开的探针杂交，利用蔗糖酶对蔗糖的催化水解作用产生葡萄糖，进而通过便携式血糖仪实现对凝血酶的检测。

技术领域

本发明涉及纸芯片技术、纳米材料技术、DNA适配体、便携式血糖仪，更具体地说是一种基于便携式血糖仪的适合现场快速检测非葡萄糖的纸分析器件的构建。

背景技术

目前具有原位快速检测，低消耗，易操作环保等优点的便携式设备已被广泛应用于日常生活中。其中商业化的便携式血糖仪已经被人们广泛使用，但是它只针对糖尿病患者血液中葡萄糖浓度进行检测。结合DNA探针利用便携式血糖仪达到检测多种目标物受到人们越来越多的关注。通过蔗糖转化酶的桥梁作用，可将便携式血糖仪用于多种目标物的检测。

由于凝血酶在心血管疾病，炎症调理，抗凝治疗过程中具有重要的意义，凝血酶的定量检测在临床中变得越来越重要。目前已有利用电化学，电化学发光，比色，荧光等方法检测凝血酶的含量，但是这些传统的方法都面临着一个操作复杂，仪器昂贵等缺陷。为了解决这些问题，构建一个简单，便宜，环保易于操作的纸基器件是非常必要的。凝血酶蛋白和对应的核酸适配体有特异性的结合位点。核酸适配体是一类能与蛋白质等靶物质特异性结合的寡聚核苷酸片段,相对于传统地抗体具有良好地化学稳定性和成熟地合成技术。我们将日常生活中普遍存在的便携式血糖仪与适配体技术结合建立了一快速、简便、低消耗高效率定量检测凝血酶方法。

目前纸基器件以其低廉的成本、简单的制作过程、便于携带和处理等优点在临床诊断和环境监测等领域得到了快速发展。粗糙的表面和复杂的内部孔洞以及负载的大量官能团大大提高了纸的有效面积，为负载更多材料提供了良好的微环境，因此基于便携式血糖仪和适配体技术检测凝血酶的纸分析器件的构建具有很重要的意义。

发明内容

本发明的目的是基于便携式血糖仪和适配体技术构建用于简便、快速、高灵敏地检测凝血酶的纸分析器件。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：

（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案，如附图1所示；

（2）将步骤（1）中设计的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，随后将打印过的A4色谱纸放置到平板加热器或烘箱中，在100 ºC下加热100 s，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；

（3）对步骤（2）中获得的纸芯片的亲水区域功能化；

（4）在步骤（3）中所得到金纳米粒子修饰的工作区域上固定5′端带有巯基的适配体链，随后采用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，使用浓度为0.01 M、pH 7.4的磷酸缓冲溶液清洗，备用；滴加20 µL 待检测的凝血酶溶液，孵育35 min 后用磷酸缓冲溶液清洗；滴加20 µL 蔗糖酶标探针孵育45 min后用磷酸缓冲溶液清洗；滴加60 µL 浓度为1 M的蔗糖溶液，反应1 h, 备用；

（5）用便携式血糖仪相匹配的试纸条置于步骤（4）所得的溶液上，吸收至血糖仪要求刻度，插入便携式血糖仪进行检测。

本发明所设计的纸芯片的尺寸如附图1所示，纸芯片为边长为20 mm 的正方形，亲水性工作区域为是直径为8 mm的圆形。

本发明所述的对纸芯片的亲水区域功能化的步骤为：

合成金纳米种子：量取100 mL二次水置于单口烧瓶中，加热到96℃，随后加入1 mL1wt% 氯金酸溶液，反应1min后，加入3.5 mL 1wt% 柠檬酸钠溶液，继续搅拌12-18 min至溶液变为酒红色；