[发明专利]耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株、在合成苯基乳酸中的应用及其合成方法

说明书

本发明公开了耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株、在合成苯基乳酸中的应用及其合成方法，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2016332，上述突变株合成苯基乳酸的方法：(1)感受态细胞的制备；(2)质粒转化感受态细胞；(3)重组突变菌株全细胞合成PLA；本发明通过紫外诱变筛选一株耐受PLA的大肠杆菌，并将其分别应用于合成D‑PLA和L‑PLA，达到了显著提高目标物产量的目的。

技术领域

本发明涉及一种耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株，属于生物技术领域。本发明还涉及上述突变株在合成苯基乳酸中的应用，以及合成苯基乳酸的方法。

背景技术

苯基乳酸(PLA)是一种含有一个手性碳原子的有机酸，其普遍存在于乳酸菌发酵产品中，结构属于苯丙素类化合物。众多研究表明该化合物具有显著的广谱抑菌效果，可以有效抑制包括食源性致病细菌、酵母和霉菌等多种微生物的生长。并且可以作为合成多种药物的中间体以及可降解聚合物的单体，在饲料添加剂、医药、化妆品等多方面都具有广泛的应用前景。

因苯基乳酸为手性化合物，为获得高光学纯度的PLA，目前为止，主要的途径是利用微生物为载体，构型专一性的酶催化合成相应构型PLA。其中合成强度最高的方法主要是采用大肠杆菌为宿主，过量表达不同来源的脱氢酶催化苯丙酮酸(PPA)还原合成PLA。尽管该方法能够在短时间内合成较高浓度的PLA，但是由于PLA本身具有较好的抑菌效果。有资料表明PLA主要通过破坏细胞壁和细胞膜使得细胞膨大、絮凝导致死亡。在PLA积累到一定浓度后，细胞将很快失去活力，导致PLA合成速率迅速下降甚至完全停止。因此，生产菌株对于产物PLA较差的耐受性是该技术的一个重要缺陷和瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一株耐受PLA的大肠杆菌突变株、利用上述突变株合成苯基乳酸中的应用，以及合成苯基乳酸的方法。

为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株(大肠杆菌Z2016，Escherichiacoli Z2016)于2016年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2016332。

上述耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株中导入质粒pET-28a-ldh^Y52V、pET-28a-ldhL后形成的重组突变菌E.coli(Z2016)pET-28a-ldh^Y52V、E.coli(Z2016)pET-28a-ldhL在合成苯基乳酸中的应用。

利用上述耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株合成苯基乳酸的方法，包括以下步骤：

(1)感受态细胞的制备

1)挑取活化后的E.coli(Z2016)在LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养；

2)按照1％接种活化菌液于BT培养基中，于16℃、250rpm培养至菌液OD₆₀₀＝0.6；

3)将培养菌液转移到灭菌预冷的聚丙烯塑料离心管中，冰上放置10min后于4℃、4000rpm离心5min；

4)弃上清液，每50mL培养物菌体沉淀用5mL冰上预冷的BT Buffer F充分重悬菌体，冰上放置15min；

5)于4℃、4000rpm离心5min收集菌体，用2mL冰上预冷的BT BufferE充分重悬菌体，按每管100μL分装到冰上预冷的1.5mL离心管中，制备好的感受态用于转化或-86℃冰箱中保存；

(2)质粒pET-28a-ldh^Y52V、pET-28a-ldhL转化感受态细胞