[发明专利]人造三维表皮模型、其构建方法和培养基

说明书

本发明涉及一种人造三维表皮模型、其构建方法和培养基。具体涉及由分离出的正常人类表皮角质细胞和人工支架构建形成人造三维表皮模型的方法、以及该方法构建的人造三维表皮模型。本发明的构建人造三维表皮模型的方法采用添加有霍乱毒素和Fetal Clone II血清的培养基。

技术领域

本发明涉及一种构建人造三维表皮模型的方法，以及该方法构建的人造三维表皮模型。具体涉及由分离出的正常人类表皮角质细胞和人工支架构建形成人造三维表皮模型的方法以及该方法构建的人造三维表皮模型。本发明方法所构建的人造三维表皮模型的角质层分化明显，并有多层角质层分化。

背景技术

皮肤药物、日用化学品(洗涤剂、清洁剂)、化妆品与生活息息相关，它们的质量和安全应当有保障。对这些产品而言，皮肤刺激性是日常使用中最常见的不良反应之一，因此皮肤刺激性试验是这些产品的安全性评价的主要项目。目前世界各国要求将这些产品，尤其是化妆品及其原料的皮肤刺激/腐蚀试验列为安全评价的检测内容。皮肤刺激/腐蚀试验在传统上采用实验动物进行。但随着人们道德要求的提高对动物福利的日益重视，对用于取代动物试验的替代方法的需求日渐增加。

2010年，欧盟批准采用重组人三维皮肤模型替代方法来取代动物试验以进行皮肤用药和化妆品刺激/腐蚀试验。2013年，欧盟禁止进口基于动物试验的化妆品。由于是否采用动物试验以外的替代方法已成为新的贸易壁垒，影响到进出口化妆品的检验检疫，因此，提升我国对皮肤药物、日用化学品以及化妆品的质量检测水平，使其达到国际专业检测水准势在必行。基于以上现状，人造三维皮肤模型在皮肤毒性检测中具有广阔的应用前景。

人造三维皮肤模型的组织结构和生理功能与正常皮肤组织十分相似，因而可作为良好的皮肤替代模型并在近年来被广泛使用。人造三维皮肤模型分为体内动物试验模型和体外人体皮肤刺激试验模型两种。体内动物试验模型在医学范畴内被应用于烧伤皮肤的移植与修复、皮肤病的发病机理、皮肤发育等研究；体外人体皮肤刺激试验模型被作为受试品用于外来化学物质对皮肤的刺激和 腐蚀的急慢性反应研究。目前国内对人造三维皮肤模型的研究重点为体内研究。

体外人造三维皮肤模型是将体外培养的具有增殖能力的皮肤细胞种植于具有生物兼容性的高分子材料中，获得与正常皮肤类似的可替代的三维皮肤。为了形成良好的体外人造三维皮肤模型，要对种子细胞、支架材料、组织构件这三方面入手进行研究。作为用于皮肤刺激/腐蚀试验的表皮模型，通常的是使用原代角质细胞或者HaCaT永生化角质细胞作为种子细胞，将聚碳酸酯膜、牛胶原等材料作为支架进行培养，得到形成类似表皮的多层结构组织。

3R原则(Reduce(减少)、Replace(替代)、Refine(优化))促进了全球对体外皮肤模型的研究，但国内动物实验成本低廉、取材广泛，导致我国对取代动物试验的替代方法的研究不够重视、相对滞后。近十年来，国内化学品安全评价中使用它鼠、兔、猪等与人皮肤相似的动物作为试验模型，而对体外人造三维皮肤模型的构建也在逐步展开。目前我国相关科研院所已经成功构建体外人造三维皮肤模型，以第三、第四军医大学为代表的机构对化学品刺激/腐蚀模型的研究着重于体外人造三维皮肤模型的构建；广东进出口检验检疫中心则着重于模型的探索构建、生物标志性研究以及毒性检测中的应用评价等。但以上研究中各项化学物皮肤刺激试验还未按照ECVAM(替代方法欧洲研究中心)发布的技术指南为标准进行验证。

皮肤模型于90年代开始用于化妆品的替代试验，到目前为止，商业化和即将商业化的皮肤组织检测模型已达30余种。所有皮肤组织检测模型均需要经历预验证-验证-应用阶段，在国外已经通过ECVAM预验证、且适用于化妆品检测的体外模型有：Episkin模型、EpiDerm模型、SkinEthic模型等。