[发明专利]一种pH不敏感荧光蛋白标记的生物组织的荧光控制方法

说明书

本发明公开了一种红色荧光蛋白DsRed标记生物组织的荧光控制方法，采用含有过渡金属离子的淬灭化学试剂将红色荧光蛋白标记的生物组织荧光蛋白淬灭，得到荧光淬灭的生物组织；采用含有金属离子螯合剂的重激活化学试剂将荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，本发明利用过渡态金属离子和氢离子的协同作用将红色荧光蛋白标记的生物组织荧光蛋白淬灭，利用金属离子螯合剂和氢氧根离子的协同作用将荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，实现DsRed标记的生物组织的荧光的精确控制，淬灭彻底完全，激活方便，效果好，对比度高；该方法可以应用于生物组织的层析成像，荧光淬灭完全，成像时不存在背景荧光干扰的问题。

技术领域

本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种pH不敏感荧光蛋白标记的生物组织的荧光控制方法。

背景技术

在生物组织中详细地获取分子和蛋白的空间分布，可以更加清楚地了解生物学信号的传导通路，解析生物功能的形成，是理解生物体结构和功能关系的重要基础。荧光蛋白标记技术作为一种有用的基因标记手段，能够在活体状态下，针对感兴趣的细胞和亚细胞结构进行标记，同时，为了更好的研究这些细胞和亚细胞结构的相互关系，在同一生物体内进行多种荧光蛋白共标记的方法，已被广泛应用于生物学及医学领域。

针对厚组织进行光学成像时，目前已有的层析技术主要有两种：一种是光学层析技术，通过光学方法抑制焦面以外的荧光从而提高z向分辨率。光学层析技术的主要限制在于其z向分辨率只能够达到500nm，并且较低的z向分辨率极大地限制了多色荧光蛋白标记的生物组织亚细胞结构成像的需求；另一种是物理层析技术，通过将生物组织包埋在树脂中，通过物理切片的方式产生组织薄片，再对组织薄片进行宽场成像，物理层析技术的主要限制在于通过这种方法进行成像的过程中，组织薄片容易丢失，操做复杂，得到的图像，其后期处理及三维配准非常困难，无法用于大体积的生物组织。

pH不敏感的荧光蛋白，如红色荧光蛋白DsRed用于标记生物组织时，由于没有合适的荧光控制方法，成像时只能采用物理层析进行大体积成像，例如采用双光子显微镜进行点扫描，成像速度很慢，而且存在背景荧光干扰、轴向分辨率低的问题。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织的荧光控制方法，其目的在于利用过渡金属离子和氢离子的协同作用将红色荧光蛋白标记的生物组织荧光蛋白淬灭，利用金属离子螯合剂和氢氧根离子的协同作用将荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，实现DsRed标记的生物组织的荧光控制，由此解决现有技术的pH不敏感的荧光蛋白标记生物组织由于荧光不能控制或缺乏合适的荧光控制方法而导致的进行荧光成像时的背景荧光干扰、轴向分辨率低、成像速度慢的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种红色荧光蛋白DsRed标记生物组织的荧光控制方法，包括如下步骤：

(1)荧光淬灭：采用淬灭化学试剂将红色荧光蛋白DsRed标记的生物组织的荧光淬灭，得到荧光淬灭的生物组织，所述淬灭化学试剂包括过渡态金属离子，所述淬灭化学试剂的pH为3～6；

(2)荧光重激活：采用重激活化学试剂将步骤(1)所述的荧光淬灭的生物组织的荧光重激活，所述重激活化学试剂包括金属离子螯合剂，所述重激活化学试剂的pH为10～13。

优选地，所述淬灭化学试剂的pH为3～5。

优选地，所述淬灭化学试剂为过渡态金属离子化合物的水溶液。

优选地，所述淬灭化学试剂为过渡态金属离子化合物的水溶液和酸的混合溶液。

优选地，所述酸为醋酸。