[发明专利]一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，属于土壤改良技术领域。

背景技术

梵净山冷杉(Abiesfanjingshanensis)，国家一级保护植物，为中国贵州省特有种，亦为第四纪残遗植物。仅残存于梵净山的局部地段，分布区极其狭窄，数量稀少，加上结实率低，自然更新不良，需加以保护才不致灭绝。被列入《中国植物红皮书》并成为国家一级保护植物，全球重点保护的针叶树种。

梵净山冷杉属阴性树种，耐荫性强，喜阴湿，常绿乔木，高22m，胸径65cm，冬芽卵球形，叶在小枝下面呈梳状，在上面密集，向外向上伸展，叶上有树脂道2个，边生或近边生，球果圆柱状长圆形，直立，成熟时深褐色，长5～6cm，直径约4cm，种子长卵圆形，微扁，种翅倒楔形，褐色或灰褐色，适宜于夏凉冬冷，雨量充沛亚热带季风山地气候，土壤为山地黄棕壤，较湿润肥沃，pH值4.5～6.5。耐荫性强，喜冷湿，一般多为纯林，也有混交林，通常5～6月开花，球果10～11月成熟。

梵净山冷杉林在梵净山东北坡的亚高山暗针叶林中，常为片状集中分布，形成优势种群，由于冷杉具有较为稠密的林冠，针叶较为宽，树梢通直，树冠成塔形等特性。结实年龄在林缘约40～50年，结实周期4～5年，且球果出籽率少，采集的梵净山冷杉球果中种子的胚极少发育，多为空瘪的膜状物。在梵净山，由于林地覆盖物较厚，严重影响幼苗、幼树的生长与发育，林下虽有小苗，却极少见到小树，导致天然更新较差，幼苗长势弱。

目前我国还未见梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，梵净山冷杉林地覆盖物清理主要依赖于自然降解辅以人工清理，严重影响梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新，使得梵净山冷杉林处于濒危灭绝的状态。因此筛选高效的梵净山冷杉纤维素降解菌，对改善梵净山冷杉林地生态环境，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新具有重要意义。

发明内容

为了克服现有的纤维素降解菌污染率高、生长周期长、工艺复杂的问题，提供一种梵净山冷杉纤维素降解菌筛选方法，使得制成的梵净山冷杉纤维素降解菌工艺简便、污染少、操作简单、周期短，极大改善梵净山冷杉林地生态环境，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。

本发明的技术方案：一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，包括以下步骤：

(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶50～80份、梵净山冷杉枯枝60～80份、梵净山冷杉树皮70～90份、胰蛋白胨6～8份、维生素B₆0.000025～0.000035份、磷酸氢二钾0.50～0.70份，氯化钠0.55～0.65份、硫酸镁0.50～0.60份、氯化钙0.55～0.65份、牛肉浸膏0.55～0.70份以及氯霉素0.008～0.010份加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；

(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶150～200份洗净以及切成块状的去皮马铃薯150～200份加入1000份水中，煮沸30～40min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖15～25g和琼脂15～20g，然后加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；

(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物20～30g放入初选培养基中；

(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、110～130r/min的菌种培养摇床中培养6～8天；

(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上25～30℃恒温培养24～36h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。