[发明专利]一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种测量刀鲚GnRH‑R含量的方法及其应用，包含以下步骤：(1)绘制GnRH‑R标准品标准曲线，所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH‑R浓度的关系曲线；(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算GnRH‑R的含量。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述测量刀鲚GnRH‑R含量的方法快速、准确，且灵敏度高；(2)所述方法检测过程中克服了以往采用同位素标记的手段，因而减少了放射性污染；(3)所述方法为探明鱼类等低等脊椎动物生殖周期调控机制奠定基础；(4)所述方法具有高特异性，能够检测痕迹量的GnRH‑R酶。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种酶的检测方法，尤其涉及一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用。

背景技术

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是下丘脑-垂体-性腺轴(Hypohthalamus-Pituitary-Gonadal axis，HPG)重要的神经内分泌因子，也是调节生殖系统功能的关键信号分子，能调节垂体及卵巢水平的卵泡刺激素(folliclestimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizinghormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E₂)、孕激素(Progestogen，P4)等多种性激素水平。GnRH通常由下丘脑的神经细胞合成并分泌，通过垂体门脉系统以脉冲的方式分泌到垂体前叶，与其促性腺细胞表面的GnRH受体(GnRH Receptor，GnRH-R)结合，促进性腺激素即FSH和LH的合成与分泌，从而维持正常的生殖系统功能。GnRH-R是GnRH发挥生物活性的必需物质。大量研究表明，GnRH存在三种亚型(GnRH1，GnRH2，GnRH3)，其功能既有交叉也有各自特异的作用。大多数高等动物机体内GnRH-R有两种类型GnRH-R I和GnRH-R II。研究发现GnRH-R不仅位于HPG系统，在动物机体的其他组织也有分布，尤其是在外周性腺组织中。检测生物机体体液内GnRH-R的含量变化是研究其生殖规律的基础条件。

研究发现GnRH-R是一种大约由327-328个氨基酸构成的，相对分子量约为38kDa的糖蛋白，结构分析发现其含7个跨膜区，是典型的G蛋白(protein G)偶联受体。当GnRH与细胞膜上的GnRH-R结合后，GnRH将激活其受体以刺激垂体前叶的多种信号通路。在GnRH或其它内源因素的刺激下，GnRH和GnRH-R结合，激活磷脂酶C(PLC)，促使多聚磷酸肌醇的分解，形成IP3和DG，IP3诱导Ca²⁺从细胞内质网中释放。GnRH与受体结合的同时也激活了Ca²⁺通道，促使细胞外Ca²⁺进入细胞内。Ca²⁺和DG激活蛋白激酶C，接着细胞内Ca²⁺和蛋白激酶C(PKC)相互作用进行细胞内反应的调控，从而诱导促性腺激素的释放。RNA印迹、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、原位杂交和受体结合分析表明，在大鼠等哺乳动物垂体细胞中，GnRH-R大量分布在表达LH或FSH的促性腺细胞上。除下丘脑-垂体轴系以外，GnRH-R在卵泡颗粒细胞和黄体细胞、睾丸间质细胞、胎盘细胞、滋养层细胞和合体滋养层细胞、正常子宫组织、乳腺组织和前列腺均有GnRH-R的表达。

研究表明，GnRH-R的表达和合成由多种内源性激素如GnRH，E₂，P₄和抑制素等的调控，而这些激素通常共同存在于血液循环中，而激素之间的相互作用也会影响到GnRH-R的表达和合成。大量研究表明GnRH-R水平在高等脊椎动物生殖周期中呈动态变化，这种动态变化模式与垂体上结合的GnRH数量和从卵巢滤泡分泌的E₂产量密切相关，这些结果反映了雌二醇、孕酮、抑制素等内分泌激素对GnRH-R相互作用的综合效应。而在鱼类等低等脊椎动物生殖周期的调控中，GnRH-R是否具有类似的调控机制一直是一个悬而未决的科学问题。