[发明专利]变异葡萄糖脱氢酶及其使用

说明书

本发明涉及变异葡萄糖脱氢酶及其使用。本发明提供一种变异葡萄糖脱氢酶，其包含变异葡萄糖脱氢酶α亚单位，所述变异葡萄糖脱氢酶α亚单位是在序列号3的氨基酸序列中，474位的天冬酰胺被甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸或半胱氨酸取代，并且，所述变异葡萄糖脱氢酶具有葡萄糖脱氢酶活性，对木糖的反应性降低。

技术领域

本发明涉及底物特异性提高的变异葡萄糖脱氢酶(GDH)。详细地讲，本发明涉及包含变异型α亚单位的GDH。本发明的GDH可以适当地用于葡萄糖传感器及葡萄糖检测试剂盒等，在生物化学领域、临床领域等中有用。

背景技术

目前，将野生型的含细胞色素C的GDH(CyGDH)及以吡咯并喹啉苯醌作为辅酶的PQQGDH用于血糖自测传感器。然而，野生型的CyGDH及PQQGDH有以下缺点：由于其不仅与葡萄糖反应而且还与麦芽糖反应，因此不能测定准确的血糖值。

专利文献1中虽然公开了对二糖类的反应性低、且在α亚单位的326位、365位以及472位具有变异的变异GDH，但显示反应性低的仅仅是针对麦芽糖，并没有公开对木糖以及半乳糖的反应性低的变异GDH。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-090563号公报。

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的课题在于，提供一种对木糖、优选木糖以及半乳糖的反应性低、且对葡萄糖的底物特异性提高的GDH。

用于解决技术问题的手段

本发明人为了解决如上所述的课题而进行了潜心研究，结果发现，通过在依次包含下面叙述的肽序列(i)～(v)的520～550个氨基酸的GDHα亚单位的氨基酸序列中、以其他氨基酸取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸、肽序列(iv)的4位的组氨酸、以及肽序列(v)的4位的天冬酰胺中的一个以上，会降低对木糖以及半乳糖的反应性，并提高对葡萄糖的底物特异性，而且，根据该发现，成功地得到葡萄糖传感器等中有用的变异GDH，从而完成了本发明。

即，本发明为以下的内容。

(1)一种变异GDH，其包含变异葡萄糖脱氢酶α亚单位，所述变异葡萄糖脱氢酶α亚单位具有在依次包含下面的肽序列(i)～(v)的520～550氨基酸的葡萄糖脱氢酶α亚单位的氨基酸序列中、以其他氨基酸取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸、肽序列(iv)的4位的组氨酸、以及肽序列(v)的4位的天冬酰胺的一个以上的氨基酸序列，其中，所述变异葡萄糖脱氢酶具有葡萄糖脱氢酶活性，对木糖的反应性降低。

(i)Val/Ile Val/Ile Val/Ile Gly Ser Gly Val Ala Gly(序列号21)

(ii)Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys(序列号22)

(iii)Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly Thr Gly(序列号23)

(iv)Lys Lys Ile/Leu His Leu SerAsn(序列号24)

(v)Phe Ala Pro/Asn Asn Asn His Ile(序列号25)

(2)根据(1)所述的变异GDH，其中，与从肽序列(ii)的8位的Met、肽序列(iii)的12位的Gly、肽序列(iv)的6位的Ser、肽序列(v)的2位的Ala、肽序列(v)的3位的Pro/Asn、肽序列(v)的5位的Asn以及肽序列(v)的7位的Ile中选择的至少一个氨基酸残基相当的氨基酸残基还被其他氨基酸残基取代。