[发明专利]一种原代人食管上皮细胞的分离及培养方法

权利要求书

1.一种人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)无菌取出食管癌患者手术切除的正常食管2cm，沿长轴纵行切开，展平，修剪去除皮下结缔组织和肌肉，再以预冷含双抗的PBS缓冲液反复冲洗后，置于此种双抗PBS缓冲液中浸泡10min；

(2)加入10ml中性蛋白酶消化，剥离上皮层和基底层；

(3)将上皮层组织剪成1mm×1mm×1mm组织碎片，加入I型胶原酶消化；

(4)用含胎牛血清和双抗的H-DMEM完全培养基终止消化，经过200目不锈钢筛网过滤，滤液1200～1500rpm离心5min，去掉上清液，保留沉淀；

(5)条件培养基配制：K-SFM无血清培养基中加入表皮生长因子，牛脑垂体提取物，氢化可的松和普通胰岛素，青霉素，链霉素；

(6)沉淀加条件培养基重悬，接种胶原包被的25cm2培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱培养；

(7)接种24h后换成含FibrOutTM成纤维抑制剂的条件培养基，每隔2～3d换液；

(8)细胞形态观察与传代；

(9)细胞鉴定。

2.根据权利要求1所述的人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(1)所述的预冷PBS缓冲液浓度为0.01M，PH值为7.2～7.4。

3.根据权利要求1所述的人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(2)所述的中性蛋白酶浓度为0.25％，消化环境为37℃，5％CO2培养箱，时间为2～3h。

4.根据权利要求1所述的人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(3)所述的I型胶原酶浓度为0.1％，消化环境为37℃，5％CO2培养箱，时间为20～30min。

5.根据权利要求1所述的人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(4)所述的胎牛血清浓度为10％。

6.根据权利要求1所述的人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述的培养基为含100μ/ml青霉素，100μg/ml链霉素、5ng/ml表皮生长因子、70μg/ml牛脑垂体提取物、0.5μg/ml氢化可的松和5mg/L普通胰岛素的K-SFM无血清培养基，PH值为7.2～7.4。

7.根据权利要求1所述的人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(6)所述的培养瓶用50μg/ml的鼠尾I型胶原包被。

8.根据权利要求1所述的人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(7)所述的成纤维抑制剂稀释浓度为1∶500。