[发明专利]一种丝状真菌寄主侵染阶段的菌丝收集方法

说明书

本发明提供了一种丝状真菌寄主侵染阶段的菌丝收集方法，其包括步骤：(1)将灭菌后的寄主叶片交替的放置于宽口瓶中，叶片与瓶底之间呈30‑60°角，宽口瓶底部放置有润湿的载体材料；所述寄主包括禾本科植物、豆科植物、亚麻科植物、菊科植物、十字花科植物的至少一种；所述载体材料包括棉花、滤纸中的至少一种；(2)将培养后的真菌菌丝接种于宽口瓶的寄主叶片上，将菌团分散均匀；所述真菌包括立枯丝核菌和稻瘟病菌。(3)将步骤(2)所得物置于培养箱培养之后，收集菌丝。本发明能高效的收集真菌菌丝，避免了常规技术中的污染问题且省时、省力、成本低；同时，所得菌丝量大、菌丝质量稳定，利于后续的科研工作。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种丝状真菌寄主侵染阶段的菌丝收集方法。

背景技术

目前，在真菌侵染阶段的转录组测序等方面的研究较少，其中的主要原因在于菌丝的采集较为困难。采用常规的方法采集菌丝，采集量少而且费时，以致于许多研究都倾向于做寄主与真菌的混合测序，但是此种方法使得真菌转录组数据中比对到参考序列的clean reads效率都比较低，局限了通过生物信息方法所进行的真菌研究。

在真菌菌丝收集的研究领域，能实现大量采集的方法主要为液体培养收集。CN104480022 A公布了利用钢丝网作为滤膜，通过过滤收集菌丝体的方法。CN 104611239 A公布了通过将菌种接种在玻璃纸上，培养后，将玻璃纸和培养基分离，收集玻璃纸上的菌丝体的方法。

然而，液体培养收集法的操作复杂，容易染杂菌，而且非常容易将培养基带入所收集到的菌丝体中，影响后续实验结果的准确性。另外，液体培养收集法还难以去除所得菌丝体中的水分。

本发明的发明人曾经尝试在固体培养基平板(直径10cm,高1cm)上接种真菌，待菌丝布满培养基，将宿主叶片插入固体培养基中，之后收集菌丝。上述方法借鉴了液体培养收集法，只不过将液体培养基替换为固体培养基，并采用了宿主叶片。该方法可一定程度上减少培养基带入菌丝体的概率。不过，发明人发现，由于一些杂菌也可以生长于所用培养基中，该方法同样难以解决染菌的问题。更为重要的是，该方法需将宿主叶片仔细的插入固体培养基中，十分费时，并且该方法所得的菌丝得率非常的低(每个培养皿仅获得不到0.04g的菌丝)，同样无法解决现有技术所面临的“菌丝采集量少且费时”的问题。

综上所述，本领域亟待寻求一种具有采集量大、染菌几率小、菌丝得率高的真菌菌丝收集方法。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种丝状真菌寄主侵染阶段的菌丝收集方法，该方法包括如下步骤：

(1)将灭菌后的寄主叶片交替的放置于宽口瓶中，叶片与瓶底之间呈30-60°角，宽口瓶底部放置有润湿的载体材料；所述寄主包括禾本科植物、豆科植物、亚麻科植物、菊科植物、十字花科植物的至少一种；所述载体材料包括棉花、滤纸中的至少一种；

(2)将培养后的真菌菌丝接种于宽口瓶的寄主叶片上，将菌团分散均匀；所述真菌包括立枯丝核菌、稻瘟病菌中的一种；

(3)将步骤(2)所得物置于培养箱培养之后，收集菌丝。

如本发明的一个实施例所示，当采用本发明方法收集菌丝时，不仅避免了传统收集方法难以避免的带入培养基而造成污染的缺点，同时所得的菌丝得率很高，当采用直径10cm，高15cm的宽口瓶时，可得0.80g以上的菌丝。

另外，重要的是，发明人发现采取本发明方法收集到的菌丝可以直接用于后续的相应生物学实验。如说明书附图3所示，用采集的菌丝进行RNA提取实验，可以看到明显的两条带(18S和28S)，且降解带几乎没有或较少，可以用于后续的一系列分子克隆和实时荧光定量以及转录组测序等实验。

所用的宽口瓶的瓶盖上有透气膜。

所述灭菌可以选择的方式为用75％的酒精润洗寄主叶片。