[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒及其应用

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒 Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。

3.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株在制备预防猪流行性腹泻的疫苗中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗，其由佐剂和灭活的PEDV-KB2013-4株疫苗原液制备而成。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的佐剂由以质量百分含量计的5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温60、93% 0.005M柠檬酸钠组成。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗经由以下方法制备得到：

a. 按照常规方法制备Vero细胞，生长液为含10%新生牛血清的DMEM，培养至细胞长成单层时接种PEDV-KB2013-4病毒；

b. 取含量为5×10⁵TCID₅₀/ml 的PEDV-KB2013-4毒株按1%接种长势良好的Vero单层细胞，置37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的 DMEM作为维持液继续培养；

c. 接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达80%以上时收获病毒，将收获的病毒在-80℃，反复冻融三次，6000 rpm离心20 min，收集上清液，即为病毒液；

d. 病毒液经20倍浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24小时得到PEDV-KB2013-4疫苗原液；

e. 配制佐剂，所述佐剂的配方含5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温60、93% 0.005M柠檬酸钠，其配制方法为：将处方量的吐温80与柠檬酸钠缓冲液搅拌混匀，再加入处方量的油酸、角鲨烷，高压均质机1200bar，进行5个循环，然后收集料液，0.22 μm PTFE膜过滤除菌；

f. 将PEDV-KB2013-4株疫苗原液和佐剂按1.5:1的体积比，无菌环境中，搅拌混合均匀，即制得所述疫苗。