[发明专利]一种获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法

说明书

本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆牛的核供体细胞的构建，特别涉及一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1基因定点插入获取打靶的牛胎儿成纤维细胞的方法。

背景技术

结核病是一种由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)在人与牛之间传播引起的世界性人畜共患病，对畜牧业生产安全、畜产品安全乃至人类健康造成了严重威胁。

NRAMP1(natural resistance-associated macrophage protein-1)又名SLC11A1(solute carrier family 11A member 1)，是研究者发现的首个与结核杆菌易感性相关的基因(Vidal S et al，1995)。在结核杆菌侵入巨噬细胞时，NRAMP1通过参与先天免疫过程促进NO产生和其它促炎症反应(Hedges JF，2013)从而抑制结核杆菌在胞内的增殖，产生抗病效果。

2013年2月，国际著名期刊《Cell》报道了加州大学旧金山分校的研究人员所发现的一种精确沉默基因的方法，称之为CRISPR/Cas9介导的打靶技术。该技术表现出许多优越性，例如可以同时沉默任意数量的基因、具有优良的靶向性、构建简单且成本低等。该技术自发明以来，迅速被广大中外研究人员应用于人类细胞以及小鼠等模式动物研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。

应用转基因技术实现家畜的品种改良具有巨大的应用潜力。通过转基因技术增强家畜对于结核杆菌的抗性，对于未来的牛结核病的预防和治疗具有重大意义。然而，目前CRISPR/Cas9技术介导的基因插入在转基因家畜中的应用非常有限。此外，如何在保证外源基因插入效率的同时，减弱该系统多变的脱靶效应至今依然亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，可以采用单一Cas9切口酶与NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体获取NRAMP1基因在牛25号染色体F-A位点(即牛FSCN1基因和ACTB基因间区域内特定序列片段)定点整合的牛胎儿成纤维细胞，以该细胞作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体(简称pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro)，该打靶载体包括目的基因NRAMP1以及用于将NRAMP1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列。

所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游577-977bp和下游616-1016bp；打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。

所述目的基因NRAMP1是由外源扩增的NRAMP1基因自身启动子启动转录的。

所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。

所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。