[发明专利]一种用于微囊藻毒素检测的微流控芯片及检测方法

权利要求书

1.一种用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，包括有机玻璃制成的基片和盖片，所述盖片热键合于所述基片上，其特征在于，所述基片上刻有微流路，所述微流路依次包括试剂1入口、混合通道、试剂2入口、反应通道、检测通道和废液出口，所述试剂1入口包括待测水样入口、辣根过氧化氢酶标记的微囊藻毒素溶液入口和PBS溶液入口，所述试剂2入口包括十二烷基磺酸钠入口、酶反应底物入口、牛血清蛋白入口、二抗入口和微囊藻毒素抗体溶液入口，所述混合通道和所述反应通道为蛇形曲折状，所述反应通道内表面经过化学改性并固定有微囊藻毒素抗原。

2.如权利要求1所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，所述基片微流路采用光刻方法，包括如下步骤：

(1)玻璃基片的表面处理：将基片放入浓硫酸中煮沸30分钟，冲水后将其放入异丙醇与丙酮为1:1的混合溶液中浸泡10分钟，然后在乙醇中超声处理10分钟，去离子水冲洗后氮气吹干，放入烘箱中150℃烘1小时；

(2)涂胶：将负胶RFJ-220经旋涂机甩涂，涂胶转速为1000rpm，30秒后，胶厚为5μm；将基片放在热板上前烘6分钟，蒸发掉光刻胶中残留的溶剂；

(3)曝光及显影：对基片进行紫外曝光，曝光能量为18.9MJ/cm2，曝光时间为9秒；曝光后的玻璃基片用显影液显影2分钟，待显影液自然晾干后，150℃坚膜35分钟；

(4)扫底胶：将玻璃基片放入等离子去胶机中2分钟进行扫底胶，去除显影后表面残留的光刻胶；

(5)刻蚀：在室温下进行，腐蚀液为添加10％HCl的不同程度稀释的缓冲氧化刻蚀液，每刻蚀20分钟后坚膜10分钟，继续刻蚀；刻蚀完成后，用发烟硝酸去除光刻胶。

3.如权利要求1所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，所述基片和所述盖片的热键合包括如下步骤：

(1)表面亲和处理：基片表面用去离子水、丙酮和无水乙醇混合溶液、去离子水依次清洗，再用稀HF酸漂洗后去离子水冲洗，再用体积比1：1的氨水：双氧水清洗，最后用去离子水冲洗；

(2)预键合：在无超净环境下，将基片和未玷污的新盖片在超纯水环境中对准贴合后，使基片和盖片紧密贴合在一起而无相互滑动，取出放进真空干燥箱，干燥1h；

(3)高温键合：将预键合后的基片和盖片平放在高温炉中，在基片和盖片上下方各放一块抛光过的石墨板，上面的石墨板上再压一块不锈钢；高温炉升温速度为10℃/min，选择在620℃保温一段时间，再以10℃/min降温至室温。

4.如权利要求1所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，所述化学改性包括如下步骤：

(1)清洗：基片所述反应通道中先用体积比为1:1甲醇和盐酸的混合液超声清洗30min，去离子水清洗后吹干；

(2)基片活化：将体积比为3:1的浓硫酸和双氧水的混合液通入到芯片通道内，80℃左右煮40min；

(3)反应结束用去离子水冲洗，再用氮气吹干芯片；

(4)硅烷化：在氮气保护下，将体积比为1:9的3-氨丙基三乙氧基硅烷和丙酮的混合液通入反应通道，50℃反应24h，自然冷却后，用去离子水清洗后60℃干燥2h，将含有过量戊二醛的磷酸缓冲液通入反应通道内，4℃反应1h，20℃反应1h，反应结束后用去离子水冲洗干净。

5.如权利要求1所述的用于微囊藻毒素检测的微流控芯片，其特征在于，微囊藻毒素抗原固定包括如下步骤：

(1)将200μL的BSA用400μL硼酸钠进行清洗两次，硼酸钠溶液浓度为50mM，pH＝8-8.2；然后用PBS磷酸盐缓冲液清洗；

(2)将清洗后的BSA通入反应通道并充满，室温下静置反应45分钟，然后用PBS磷酸盐缓冲液清洗反应通道，氮气吹干；

(3)将过量10倍的二抗溶解到硼酸钠溶液中，注入反应通道中，室温浸没45分钟，然后去除多余的液体；然后用PBS磷酸盐缓冲液清洗；

(4)将5μL 50％戊二醛加入到反应通道中，室温下反应1小时；然后用PBS磷酸盐缓冲液清洗；

(5)最后用1M NaCl、0.1M甘氨酸、纯水、PBS磷酸盐缓冲液依次进行清洗。