[发明专利]一种荧光蛋白质染色剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种荧光蛋白质染色剂及其制备方法和应用，该蛋白质染色剂的结构式为其水溶液具有强烈的荧光，且该染色剂含有醛基，能与蛋白质上的氨基反应形成共价键，可用于蛋白质的染色，具有染色牢固、不易脱色、使用方便、操作步骤少、节约时间、灵敏度高的优点，提高了染色与荧光检测效果，有利于荧光或裸眼识别与检测。

技术领域

本发明属化学与生物传感技术领域，具体涉及一种具有荧光性能的蛋白质染色剂，以及该蛋白质染色剂的制备方法和应用。

背景技术

有机小分子荧光探针广泛的应用于环境科学、生命科学和材料科学等领域，并日益成为现代生命科学及疾病诊断等领域不可缺少的研究手段，因此，开发具有实用价值的功能性荧光染料分子倍受关注。以有机荧光团为基础的分子荧光探针具有灵敏度高、操作简便、重现性好、膜透性好、原位检测等众多优点。而且，荧光染料常用作荧光探针，在标记生物分子或微粒的生物工程与医疗检测领域具有重要应用。目前，许多的应用是利用荧光染料作为检测工具，其需要荧光染料与蛋白质、氨基酸、核酸及其他的生物分子共价结合形成染料标记的配体。

十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是Shapiro于1967年建立的，经过不断的改进、完善，现在已广泛应用于蛋白质分析。由于SDS覆盖蛋白质分子，使蛋白质能够根据分子大小带有相应的负电荷，使得蛋白质的电泳迁移率不受其原有电荷影响，而只与相对分子质量有关。因此通过SDS-PAGE可分离蛋白并测定蛋白质相对分子质量和蛋白质纯度。在采用SDS-PAGE分析蛋白质特性时，考马斯亮蓝、银染等是应用最为广泛的蛋白染色剂，但是它们都需要进行单独的染色和脱色过程，步骤繁琐，操作要求高，且银染稍有不慎会造成很深的背景，影响结果的清晰度，最严重的是，有的银染胶脱色困难；考马斯亮蓝染色虽然染色背景低，但灵敏度低且消耗时间长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定性好、固色性强的荧光蛋白质染色剂，并为该染色剂提供一种制备方法和应用。

解决上述技术问题所采用的技术方案是该荧光蛋白质染色剂的结构式如下：

上述荧光蛋白染色剂的制备方法如下：

1、在0℃、搅拌条件下，将干燥的环己酮和浓硫酸混合，然后加入4-二乙氨基酮酸，待4-二乙氨基酮酸完全溶解后，升温至85～95℃，恒温反应1.5～2小时，冷却至常温，将反应液倒入冰中，再加入质量分数为70％的高氯酸水溶液，过滤并用冰水洗涤，所得固体真空干燥。

2、在0℃、搅拌条件下，将POCl₃和N,N-二甲基甲酰胺按体积比为1:2.5～3.5混合；将步骤1真空干燥后的固体完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺后，滴加到N,N-二甲基甲酰胺和POCl₃的混合液中，滴加完后升温至85～95℃，恒温反应3～4小时，冷却至常温，将反应液倒入蒸馏水中，分离纯化产物，得到荧光蛋白染色剂。

上述步骤1中，优选4-二乙氨基酮酸与环己酮的摩尔比为1:1.5～2.5，干燥的环己酮和浓硫酸的体积比为1:10～15。

上述步骤2中，优选步骤1真空干燥后的固体与POCl₃的摩尔比为1:1～1.5。

上述荧光蛋白染色剂在蛋白质染色中的用途，染色方法为常规蛋白质染色方法。

本发明的有益效果如下：

1、本发明染色剂的水溶液具有强烈的荧光，且该染色剂含有醛基(—CHO)，能与蛋白质上的氨基(—NH₂)反应，形成共价键，利于在染色时与客体产生相互作用，染色牢固，不易脱色，提高了染色与荧光检测效果，提高了灵敏度，有利于荧光或裸眼识别与检测。同时，本发明染色剂具有色泽鲜艳、色谱齐全、优异耐洗牢度、价格相对便宜、应用工艺简便的特点。