[发明专利]分析甲萘威残留的ELISA检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基于ELISA法的农药残留分析技术，具体地说，涉及一种分析甲萘威残留的ELISA检测试剂盒及其应用。

背景技术

甲萘威是一种氨基甲酸酯杀虫剂，这类农药残留的常规检测主要是应用仪器分析法，包括气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等。这些分析方法所需的仪器价格昂贵，样品的分离、提取、净化、衍生等前处理复杂，分析速度慢、检测灵敏度低，难以满足现场快速检测需求。许多理化分析技术本身存在局限性，如甲萘威的热稳定性差，难于用气相色谱法分析，而液相色谱尚缺乏选择性好的高灵敏度检测器等。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求。

胆碱酯酶抑制法是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的抑制作用原理而建立的一种农药残留检测方法，具有通用性强、简便快速等优点，一定程度上满足了现场检测需求，但其灵敏度低，在0.1-10mg/L范围内，检测结果不稳定，难以满足痕量检测需求。因此，亟待开发一种高效农药残留快速分析技术。

基于常规抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)的甲萘威残留酶联免疫吸附分析方法稳定性相对较低，本发明以抗甲萘威纳米抗体为基础，采用酶联免疫吸附分析方法，其热稳定性均优于多克隆抗体免疫分析方法。

发明内容

本发明的目的是针对目前农药残留仪器分析方法成本高、前处理复杂、特异性差、灵敏度低和难以实验现场检测等缺点，提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的，分析甲萘威残留的ELISA检测试剂盒。适用于水、土壤等样品中甲萘威残留的快速测定。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种抗甲萘威纳米抗体，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述抗甲萘威纳米抗体可以按如下方法进行制备：利用化学反应合成甲萘威的半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸，将半抗原与钥孔血蓝蛋白偶联后作为免疫原，免疫实验动物羊驼，提取外周血淋巴细胞的总RNA，经反转录及巢式PCR，克隆出纳米抗体重链(VHH)基因片段，通过酶切连接，将基因片段克隆至噬菌粒载体，高效电转化至大肠杆菌，经辅助噬菌体拯救，构建得到噬菌体纳米抗体库，筛选出特异的甲萘威噬菌体纳米抗体，将其表达纯化，得到灵敏度高，特异性强的抗甲萘威纳米抗体。制备的纳米抗体分子小，可溶性强，耐高温，易纯化，易表达。

本发明的分析甲萘威残留的ELISA检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂，其中，所述酶标板的每个孔包被有甲萘威包被抗原，所述试剂包括所述抗甲萘威纳米抗体、甲萘威标准溶液、酶标记的二抗、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液(A液)、显色液(B液)和反应终止液等。

所述甲萘威包被抗原为半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸与牛血清蛋白的偶联复合物，所述包被抗原的制备方法如下：(1)将30.2mg N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸、13.9mg N-羟基琥珀酰亚胺和24.3mg N,N'-二环己基碳二亚胺溶于1mL无水二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜反应。将反应液离心(5000rpm，10min)，弃沉淀，收集上清液，上清液中含有活性酯。(2)将牛血清蛋白20mg溶于0.05M，pH 9.6的碳酸盐缓冲液2mL中，搅拌下逐滴加入所述上清液，滴加时缓慢，约20min加完。然后室温下继续搅拌反应4h。(3)反应结束后，将反应液装入透析袋内用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)透析；每6h换液一次，共换液5-6次。透析后离心，弃沉淀，收上清液，作为抗原包被液。

所述酶标板为96孔酶标板，包被抗原的包被浓度为100ng/mL。

所述纳米抗体的浓度为0.535ng/mL。

所述酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标记的抗HA标签抗体，浓度为0.1μg/mL。购自Abcam公司，商品编号:ab1265。

所述显色液A液由过氧化脲1g、柠檬酸10.3g、Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g、吐温-20 100μL和蒸馏水1000mL配制而成，pH值5。

所述显色液B液由四甲基联苯胺700mg、DMSO 40mL、柠檬酸10.3g和蒸馏水1000mL配制而成，pH值2.4。

所述反应终止液为2M的硫酸液。