[发明专利]一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法

权利要求书

1.一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）功能化磁珠的制备

取25mg/mL羧基化的磁珠4μL，在外部磁场的作用下，用50mM，pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液冲洗三遍，向冲洗后的磁珠中加入0.2M 的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和0.2M 的N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液200μL，室温震荡反应30min以活化磁珠表面的羧酸基团，将活化后的磁珠用50mM Tris-HCl溶液冲洗三遍后重新分散于400μL浓度为50mM，pH=6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，再加入10μL浓度为1mg/mL 癌胚抗原CEA包被抗体，室温震荡反应3h，再加入200μL含2%（w/v）牛血清白蛋白的50mM，pH=7.4的Tris-甘氨酸溶液，室温震荡封闭反应1h，在外部磁场作用下，将已进行功能化的磁珠用Tris-HCl溶液洗净，重新分散于400μL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；

（2）脲酶功能化金纳米探针的制备

取1mL直径为13nm的金纳米粒子于样品管中，用浓度为0.1M Na₂CO₃溶液调节至pH=8.5，依次加入5μL浓度为1mg/mL的癌胚抗原CEA标记抗体和100μL浓度为2mg/mL的脲酶，混匀组装1.5h后4℃下放置过夜，再将所得产物离心，除去多余的癌胚抗原CEA标记抗体和脲酶，将产物重新分散于0.8mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，再向其中加入200μL含2%（w/v）的牛血清白蛋白溶液，室温封闭反应1h后，将得到的脲酶功能化的金纳米粒子经过离心洗净，分散于1mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；

（3）标准溶液中CEA含量的检测

分别取制备好的功能化磁珠40μL置于6个样品管中，将浓度为1mg/mL CEA标准溶液用50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液分别稀释成浓度梯度为0.001，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的CEA标准储备溶液，依次将上述6个不同浓度的CEA标准储备液100μL分别置于上述6个样品管中，在37℃震荡培育20min，在外部磁场作用下，用含0.05%（w/v）吐温的浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液和Tris-HCl溶液交替洗净，再分别向每个样品管加入100μL的脲酶功能化金纳米探针，在37℃震荡培育20min，将所得产物在外部磁场作用下洗涤三次后，再向样品管中加入浓度为0.25M的尿素和浓度为0.5M的Cu²⁺混合液100μL，37℃恒温震荡反应10min，再将所得产物用浓度为50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中清洗干净，再向其中加入10μL浓度为0.1M HCl溶液，静置反应5min后向其中加入100μL浓度为10μM铜离子检测试剂，所述铜离子检测试剂是溶于Tris-HCl和四氢呋喃体积比为1/9的溶液中，首先通过肉眼初步观察颜色变化，初步判断标准品中CEA的浓度，再在外部磁场作用下，磁分离取上层清液在紫外可见分光光度计测定标准品中CEA的含量；

（4）样品中CEA含量的检测

取临床血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，样品的处理方法同上述标准溶液，检测血清样品中CEA的含量。