[发明专利]一种磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种双组分共聚物，其特征在于，所述双组份共聚物具有如下所示的分子结构：

其中R为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基；X＝0.01-0.5。

2.一种磷酸化肽富集材料，其特征在于，包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，所述双组分共聚物的分子结构如权利要求1所述，所述双组分共聚物层的厚度为10-80nm。

3.如权利要求2所述的磷酸化肽富集材料，其特征在于，所述基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。

4.如权利要求2或3所述的磷酸化肽富集材料的制备方法，其特征在于，该制备方法是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将双组分共聚物接枝到基底表面，具体制备方法如下：

1)在反应容器中依次加入异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体，同时加入超纯水及二甲基甲酰胺的混合溶液作溶剂，其中，异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体的摩尔比1-20:1，超纯水与二甲基甲酰胺的体积比为1:1-10；

2)在无氧条件下加入催化剂和配体，将基底浸入前述溶液中，保持氮气气氛，在恒温60-80℃条件下进行原子转移自由基聚合反应4-24小时；

3)反应结束后，洗涤基底表面并在30-80℃下真空干燥，得到所述磷酸化肽富集材料。

5.如权利要求2或3所述的磷酸化肽富集材料在磷酸化肽富集分离中的应用方法，其特征在于，采用柱固相萃取模式，具体步骤如下：

1)将磷酸化肽富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用活化液和平衡液活化及平衡微固相萃取柱，将蛋白酶解物溶解于平衡液中，并上到微固相萃取柱上，磷酸化肽富集材料与蛋白酶解物的质量比为100:1-1000:1；

2)采用5-200倍柱体积pH 0-7的有机溶液冲洗萃取柱；

3)采用5-100倍柱体积pH 3-7的有机溶液洗脱得单磷酸化肽；

4)采用5-100倍柱体积pH 0-3的有机溶液洗脱得多磷酸化肽，上述整个过程在10-60℃进行。

6.如权利要求2或3所述的磷酸化肽富集材料在磷酸化肽富集分离中的应用方法，其特征在于，采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：

1)先采用活化液活化磷酸化肽富集材料，将该磷酸化肽富集材料与蛋白酶解物以质量比为100:1-1000:1混合，孵化0.5分钟-12小时，过滤或者分散固相萃取分离，弃上层清液，收集沉淀；

2)采用pH＝0-7的有机溶液对沉淀清洗；

3)将清洗后的沉淀采用pH 3-7有机溶液洗涤，过滤或者分散固相萃取分离，收集上层清液；浓缩得到单磷酸化肽；

4)将清洗后的沉淀采用体积pH 0-3有机溶液洗涤，过滤或者分散固相萃取分离，收集上层清液，得多磷酸化肽，上述整个过程在10-60℃进行。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述有机溶液、活化液和平衡液均为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂的体积浓度为10％-95％，有机酸的体积浓度为0.1-5％。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有机溶液、活化液和平衡液均为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂的体积浓度为10％-95％，有机酸的体积浓度为0.1-5％。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述活化液中有机溶剂体积浓度为10-50％，pH＝0-7。

10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述平衡液中有机溶剂体积浓度为50-95％，pH＝0-7。