[发明专利]一种抗衰老活性分子

权利要求书

1.一种抗衰老活性分子——多球壳菌素，将多球壳菌素处理裂殖酵母细胞，显示多球壳菌素显著延缓了细胞衰老。内容包括以下方面：

a)多球壳菌素储液制备：将多球壳菌素固体粉末5mg，加入5ml95％的乙醇做溶剂，65℃恒温水浴加热3-5min，使其充分溶解，得到1mg/ml的储液后，取1.5ml EP管，加入95％的乙醇600μl，加入1mg/ml的储液400μl，混匀，得到400μg/ml的储液，将得到的储液存放于-20℃保存；

b)细胞培养：将所需的裂殖酵母菌株，接种于YES固体平板上，30℃培养2-3天，活化菌种；挑取菌落于装有YES液体培养基的大试管中培养过夜，得到饱和过夜培养液；向盛有25ml已灭菌的YES液体培养基的150ml三角瓶中加入多球壳菌素储液，使其终浓度为600ng/ml，另一瓶对照组加入95％的乙醇；稀释饱和过夜培养液加入到2只盛有25ml已灭菌的YES液体培养基的150ml三角瓶中，保证起始浓度为1×105cells/ml，即OD600＝0.01；30℃，220rpm培养，在特定时间点测定其存活率；

c)多球壳菌素延缓细胞衰老：用分光光度计测定菌液OD600，取0.5OD600的菌液5000rpm离心3min，用无菌水洗涤细胞一次后加入1ml无菌水，加入1mg/ml的Phloxin B储液，使其终浓度为5μg/ml；于30℃摇床避光温育2h；用1×PBS将细胞洗涤3次，置于荧光显微镜下，检测并拍照，统计死活细胞比例，计算出存活率。

2.根据权利要求1所述之一种抗衰老活性分子——多球壳菌素，其特征在于，所述

a)步骤包含如下具体工艺：

从艾露生物科技有限公司购买固体多球壳菌素5mg/瓶，品牌CERTIFICATE OFANALYSIS，加入5ml95％的乙醇，瓶子一次装不下5ml液体，可分3次或4次加入后，将其转移至15ml EP管中，使瓶中不残留固体粉末，65℃恒温水浴加热3-5min，使其充分溶解，得到1mg/ml的储液，取1.5ml EP管，加入95％的乙醇600μl，加入1mg/ml的储液400μl，混匀，得到400μg/ml的储液，将得到的储液存放于-20℃保存，使用时，若发现有白色不溶物析出，可于65℃恒温水浴加热3min使其充分溶解，呈澄清无色液体，再行使用；

b)步骤包含如下具体工艺：

从-80℃取出所需的裂殖酵母菌株，接种于YES固体平板上，30℃培养2-3天，YES培养基成分为：葡萄糖30g/L；酵母提取物5g/L；组氨酸，丝氨酸，亮氨酸，尿嘧啶，腺嘌呤各225mg/L；固体平板需加20g/L琼脂，液体培养基不加琼脂；挑取3-4个菌落于装有2.5ml YES液体培养基的带棉塞的大试管中培养过夜，试管型号20mm×20cm，得到饱和过夜培养液；配制YES液体培养基，分装于2只150ml三角瓶中，每瓶装25ml YES培养基，121℃，20min灭菌；向盛有25ml已灭菌的YES液体培养基的150ml三角瓶中加入37.5μl的400μg/ml的多球壳菌素储液，使其终浓度为600ng/ml，另一瓶加入37.5μl的95％的乙醇，轻微振荡混匀；稀释饱和过夜培养液加入到2只盛有25ml已灭菌的YES液体培养基的150ml三角瓶中，保证起始浓度为1×105cells/ml，即OD600＝0.01，此步需要测定饱和过夜培养液的OD600，方法如下，在超净工作台中，取已灭菌1.5ml EP管加入900μl无菌水，再从三角瓶中用移液器吸出100μl细胞培养液于900μl无菌水中，即将培养液稀释10倍，用分光光度计测定稀释后的菌液OD600，得到的OD600值乘以相应的稀释倍数即10倍得到过夜培养液的OD600；置于恒温振荡培养箱中，30℃，220rpm培养，2天后即48h记为CLS Day1，开始检测存活率。