[发明专利]一种用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的培养基及方法

说明书

本发明涉及一种用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的培养基，所述培养基包括1.0mg/L的6‑BA、0.2mg/L的TDZ、0.05mg/L的2,4‑D，以及0.1mg/L的GA₃；还涉及一种用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的方法，包括步骤：(1)预培养；(2)农杆菌侵染和共培养；(3)筛选培养；以及(4)生根培养。本发明以取材广泛易得的马铃薯试管苗茎段为外植体，建立茎段的体胚高效再生及遗传转化的培养基，可获得90％～100％的芽分化效率，同时改进培养方式、调节农杆菌侵染浓度，提高了转化和筛选效率，经过30d左右的筛选即可获得大量转基因株系，整体所需周期大大缩短。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的培养基及方法。

背景技术

马铃薯属同源四倍体，一般利用块茎无性繁殖，品种间的遗传基础狭窄且缺乏优良基因，常规育种难以迅速培育出满足生产所需的高抗病、高淀粉等专用型品种。近年来生物技术育种逐渐被应用到马铃薯遗传改良中，其中的基因工程技术以其高效、快速、目的性强等优点为品种改良提供了新途径。

无论是基因功能的验证还是通过基因工程改良品种都需要将目的基因转入受体基因组中，比较常用的是农杆菌侵染法。转化效率的高低在很大程度上取决于外植体的再生效率和农杆菌侵染条件，因此建立高效再生体系并探寻最佳转化条件，对于获得马铃薯转基因材料至关重要。马铃薯试管苗的叶片、茎段、试管薯以及微型薯都可用作外植体，但再生效率差异大，并且不同品种具有较大的基因型差异。王红梅等用四个品种的试管薯为外植体使用培养基MS+1.0mg L^-1IAA+0.5mg L^-1 6-BA+2mg L^-1ZT+0.2mg L^-1GA₃，均能诱导芽再生，但不同品种间表现出明显差异，最高为38.64％，最低为2.85％，不能满足用于遗传转化至少要有80％以上再生率的要求，此外在研究中试图用其它细胞分裂素替代较贵的玉米素ZT(Sigma)但均未成功。已报道的较为成功的转基因体系包括以鄂马铃薯3号、甘农薯2号、川芋10号的试管薯或微型薯切片为外植体建立，通过农杆菌侵染法获得转基因材料。由于再生效率具有较大的基因型差异，所以这些品种所用的激素配比和转化效率不同，分别是0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+1.0mg/L IAA+0.2mg/LGA₃，再生培养需60d以上，转化率40％以上；3.0～4.0mg/L ZT+1.0mg/L IAA，再生培养需45d以上，转化率50％以上；2.5mg/L 6-BA+0.25mg/L 2,4-D+0.25mg/L IAA，再生培养需60d以上。

植物组织培养要经脱分化产生愈伤，然后再经分化形成完整植株。分化过程有两种不同途径，一为器官发生途径，即由愈伤产生不定芽、不定根的过程。且芽和根是独立形成，它们之间没有共同的维管束联系。另一种是体细胞胚胎发生途径，即愈伤表面或内部的细胞经历类似于受精细胞分化形成合子胚的过程而形成了胚状体(又称体细胞胚)，它的形成过程中也会有球形胚、心形胚、子叶形胚等不同发育阶段。一般认为器官发生途径起源于多个细胞，而体细胞发生途径只起源于一个细胞，长成的植株遗传组成稳定且一致，不存在嵌合现象。转化外源基因效率的高低与受体的再生效率相关，高的再生效率是获得转基因材料的重要保证。研究表明胚性细胞系的再生效率高，分裂能力强更易于接受外源基因且由于是单细胞起源可避免形成嵌合体，获得真正的转基因植株。

现有的马铃薯试管薯或微型薯遗传转化体系能获得个别品种的转基因株系，但诱导试管薯和微型薯需要时间长，存在污染风险，所需人工以及激素玉米素的成本高；不能明确再生途径是否是体细胞胚胎途径，可能存在遗传组成不一致的嵌合问题。

因此，有必要提供一种高效快速、成本低、用于马铃薯茎段体胚的高效再生及遗传转化的激素配比以及方法。

发明内容