[发明专利]一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法

权利要求书

1.一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）细胞分离：从成年健康绵羊颈静脉采血，用等体积PBS稀释全血后，先在离心管中加入常温人外周血淋巴细胞分离液，然后将稀释后的血缓缓加到分离液液面上方，在室温下，选择水平转子700~800 g（2000~2500 rpm）离心20~30min，吸取血浆层与分离液层之间的细胞沉淀；

（2）细胞培养：将细胞沉淀用添加10% FBS，5%绵羊血清，200 IU/mL链霉素和青霉素与10 μg/mL环丙沙星的RPMI 1640高糖培养基进行细胞重悬，按照10⁶密度铺至10cm直径的细胞培养皿，置于含5% CO₂的37℃细胞培养箱中培养；

（3）细胞的消化与传代：细胞在培养2h后用PBS洗涤去除未贴壁细胞，重新加入新鲜的上述培养基培养，48h后，用PBS洗涤去除培养基后，加入含EDTA的0.25%胰酶消化液0.5mL，置于含5%CO₂的37℃细胞培养箱中孵育5min，然后用吸管吹打使细胞脱落，重悬为单个细胞，加入培养基终止消化后，将细胞转移至新的培养皿中继续培养；

观察细胞生长至50%铺满状态时进行细胞传代，在培养的第3代，将细胞培养基中的RPMI 1640高糖培养基减少50%，同时添加等体积的DMEM高糖培养基，再次培养和传代3次；

（4）细胞亚克隆：待培养得到肉眼可见的细胞克隆后，使用细胞克隆环将细胞克隆罩住，对单一细胞克隆进行消化、重悬后，转移至6孔细胞板进行继续传代培养；

（5）细胞的继续传代培养：待细胞生长至铺满且呈现成纤维状细胞形态后再传代，在第6代后，将培养液中的RPMI 1640高糖培养基全部更换为添加10% FBS，5%绵羊血清，200 IU/mL链霉素和青霉素与10 μg/mL环丙沙星的DMEM高糖培养基进行传代培养，每隔20代对传代细胞做一次冻存备份，细胞继续传代至50代。

2.一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系，其特征在于，利用权利要求1所述的方法建立得到。