[发明专利]暗色环纹炭团菌的分离方法

说明书

本发明公开了一种暗色环纹炭团菌的分离方法，包括以下步骤：步骤一、取三七的茎部，洗净，消毒后去除表皮组织，加入无菌水研磨并稀释得到稀释液；取稀释液于改良的PDA培养基上分离培养得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养得多种菌株，然后移至改良的PDA培养基上增殖培养后，保存；步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养，其抑制率大于或等于90％的菌株即为暗色环纹炭团菌。本发明具有分离方法简单，易操作，分离得到的暗色环纹炭团菌对三七灰霉病、三七圆斑病、苦玄参褐斑病、艾纳香条斑病、广西莪术叶斑病、草豆蔻叶斑病和罗汉果斑枯病等病原菌菌丝抑制率强的有益效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种暗色环纹炭团菌的分离方法。

背景技术

三七具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效，是一种中国传统名贵药材。近年来，对三七原材料的需求日益增长，但是栽培过程中的真菌病害严重影响了三七生长。三七黑斑病、能侵染三七植株和地下根系，以茎、叶、花轴受害较重，根部感染后呈褐色湿腐状，四季均可发生。三七圆斑病可为害植株各个部位，叶片发病初期叶背面呈现黄色小点，在天气潮湿或连续阴雨天，迅速扩大成透明状圆形，可引起芽腐和茎基腐。三七灰霉病以危害叶为主，多从下部老叶的叶尖或近地部分叶柄发病，灰褐色病斑，腐烂。在广西三七的传统产区，由于低海拔及高温多湿的气象条件，这种病害往往是同时发生的，造成了三七的大量减产甚至绝收，给种植户带来了巨大的经济损失。

目前，在三七种植上，防治真菌病害过度依赖化学农药，大量化学农药的使用不仅影响了三七的品质，也造成了三七药材的大量农药残留。因此，开展生物防治三七真菌病害对三七产业的可持续发展是非常迫切和必要的。为此筛选出能同时拮抗这些病害的拮抗菌具有重大意义。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种暗色环纹炭团菌的分离方法，通过此方法首次在三七中分离得到暗色环纹炭团菌，且分离得到的暗色环纹炭团菌对三七灰霉病、三七圆斑病和三七黑斑病病原菌菌丝具有很强的抑制作用，同时还对苦玄参褐斑病、艾纳香条斑病、广西莪术叶斑病、草豆蔻叶斑病和罗汉果斑枯病病原菌菌丝具有很高的抵制率。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种暗色环纹炭团菌的分离方法，暗色环纹炭团菌是从三七中分离获得。

优选的是，暗色环纹炭团菌是从三七的茎部分离获得。

优选的是，包括以下步骤：

步骤一、取三七的茎部，用流水将其冲洗干净，进行无菌消毒处理，在无菌条件下去除表皮组织，加入无菌水研磨得到研磨液，再用无菌水将研磨液稀释至其体积的100～1000倍，得到稀释液；取稀释液涂布于改良的PDA培养基上，置于25～28℃的培养箱中分离培养42～54h，得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养42～54h，培养温度为25～28℃，得多种菌株，然后将获得的多种菌株转移至改良的PDA培养基上增殖培养42～54h，培养温度为25～28℃，然后置于4℃环境下保存，备用；

其中所述改良的PDA培养基包括PDA、0.04～0.1mg琥珀酸钠和100～150mL的三七茎叶原浆；

步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养3～5d，对峙培养温度为25～28℃，其抑制率大于或等于90％的菌株即为暗色环纹炭团菌。

优选的是，无菌消毒处理具体为：用质量分数为75％的酒精浸泡2～5min，酒精要盖过三七的茎部，然后将三七的茎部移至质量分数为1％的次氯酸钠溶液中浸泡3～8min，次氯酸钠溶液要盖过三七的茎部，再用无菌水冲洗4～6次。