[发明专利]一种深海新型热稳定性碱性酯酶及应用

说明书

本发明公开了一种深海细菌来源新型热稳定性碱性酯酶E6及其编码基因与应用。本发明涉及酯酶基因e6来自深海细菌Croceicoccus marinus E4A9^T，所述的酯酶基因经异源表达后，底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高，酶活为75.2U/mg。酯酶E6酯酶催化水解最适pH为11.0；在40、50和60℃中孵育60min后，仍能保持50％以上活性；在有机溶剂和金属离子存在条件下，酶学活性较高。该酯酶具有热稳定性和碱性特征，可应用于精细化工、制药、洗涤和废水处理等工业领域高温高碱条件下的工业生产。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种深海细菌来源新型热稳定性碱性酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

海洋是一个巨大的微生物资源宝库，蕴含着大量的类型多样、功能未知的新型基因。近年来，为满足人们日益增长的生产和生活需求，一些能适应极端反应条件的应用酶在工业生产中发挥了重要的作用，从海洋等极端环境中筛选的具有耐高/低温、耐酸/碱、耐盐、耐重金属等新特性的功能基因也越来越受到人们的重视。脂类水解酶是一类能够催化酯类化合物的水解和合成的酶，在手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理等领域具有广泛的应用潜力。微生物由于其来源的酯酶具有产量高、反应稳定、副产物毒性小及分子生物学操作简单等优点，成为工业应用酯酶的主要来源。

碱性酯酶由于在高pH下具有较高或最好的活性，在药物合成、洗涤、原料脱脂和废水处理等工业中比中性酯酶更具应用潜力，已受到广泛关注。然而目前国内授权的碱性细菌酯酶专利还较少。中国专利201110208211.0提供了一种南海沉积物宏基因组来源的碱性酯酶。中国专利201510181731.5提供了一种嗜热脂环芽孢杆菌来源的碱性热稳定性酯酶，其反应最适pH和温度分别为8.5和65℃，并可在高pH和高温处理下保持较高活性。中国专利201510668911.6提供了一种盐湖嗜碱菌来源的低温碱性酯酶，其反应最适pH为9.0，并可在0℃条件下保持70％以上活性。

本发明从一种深海细菌中筛选到一种新型碱性酯酶基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有碱性、热稳定性、耐金属离子和耐有机溶剂等特点，可用于精细化工、制药、洗涤和废水处理等工业领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的深海细菌来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明提供了一种能表达热稳定性碱性酯酶基因的菌株Croceicoccus marinusE4A9^T。该细菌分离自太平洋深海沉积物，分类命名为Croceicoccus marinus，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1.6776，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(100101)，保藏日期为2007年4月9日。

本发明针对分离自深海沉积物的细菌Croceicoccus marinus E4A9^T，基于全基因组序列分析筛选获得酯酶基因e6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。酯酶基因e6大小为1338bp，碱基组成为204A(15.25％)、206T(15.40％)、464C(34.68％)和464G(34.68％)，编码蛋白大小为445个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该酯酶E6序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的是同科(赤杆菌科Erythrobacteraceae)细菌Erythrobacter sp.QSSC1-22B中的酯酶，相似性为63％(其在GenBank数据库中的注册号为OBX19645.1)。系统发育分析结果表明，活性位点丝氨酸附近序列为具有甘氨酸-X-丝氨酸-X-甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为196至200)，198位丝氨酸与311位谷氨酸和353位组氨酸共同构成酯酶催化中心。综上所述，E6应为酯酶家族中的一名新成员。