[发明专利]用于人BRAF基因突变检测的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种人BRAF基因突变检测的引物、探针及试剂盒及其应用。本发明筛选的特异性ARMS引物及探针及优化的反应体系，尤其是自制Taq酶的应用，能够在较低使用量的情况下获得检测性能优异的用于人BRAF基因突变检测的试剂盒，该试剂盒检测快速，90分钟即可完成检测；灵敏度高，可以检测10ng DNA样品中含量低至5％的BRAF基因突变；特异性高，与野生型样品无扩增；操作简便，成本低廉，有利于规模化，市场化。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种人BRAF基因突变检测的引物、探针及试剂盒。

背景技术

BRAF基因是RAS基因的下游基因，属于RAF基因家族，与RAS基因一起调控RAS-RAF-MEK-ERK-MAP激酶信号通路，介导细胞对生长信号的反应。BRAF突变后，上述信号通路被持续激活，从而引起细胞的异常增值分化。在恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等癌症中均发现不同比例的BRAF突变，其中V600E突变占BRAF突变的90％以上。

BRAF基因突变与表皮生长因子受体抑制剂，如西托昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab)等药物的治疗效果相关。西托昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗可选择性地与正常细胞(皮肤和毛发)和肿瘤细胞(如结肠癌、直肠癌)表面的表皮生长因子受体特异性地结合，从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。临床研究表明，无BRAF基因突变的患者可从西托昔单抗和帕尼单抗等靶向单抗药物治疗中获益，对于BRAF存在突变的患者西托昔单抗和帕尼单抗的治疗无效。因此，2010年美国国立综合癌症网络(NCCN)推荐在使用西托昔单抗和帕尼单抗进行治疗前，要对患者BRAF基因进行检测，对于存在BRAF基因V600E突变的患者，不推荐使用西托昔单抗和帕尼单抗进行治疗。

现有的基因突变检测方法主要有直接测序、限制性小片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、高分辨率溶解曲线分析(HighResolution Melting Curve Analysis，HRM)等。直接测序法灵敏度较低，检测周期长，成本高昂，通量不高，而且是非闭管反应，难以避免交叉污染。RFLP法存在检测周期长，操作繁琐，成本高昂，易污染等不足。HRM法同样存在操作复杂，难以避免污染等缺点。

本申请采用扩增阻滞突变系统技术(Amplification Refractpry MutationSystem，ARMS)与Taqman探针相结合的方法检测BRAF基因突变。扩增阻滞突变系统又名等位基因特异PCR，是基于PCR技术检测点突变或多态性的技术ARMS引物的3’末端设计在突变位点，最后一个碱基与突变的碱基配对；采用无3’-5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶，可特异性地识别引物3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效扩增。对于替换突变，在使用ARMS引物时，由于野生型与突变型只有一个碱基的差别，当野生型模板含量高时，可能发生无效的引物结合，由此产生非特异性扩增。因此，在引物3’端再人为引入一个错配碱基，这样野生型模板即有两个错配碱基，可大大提高引物对突变型模板的特异性；对突变型模板只有一个错配碱基，且不在3’末端，通过实验，可筛选与突变模板具有高结合效率的引物。采用ARMS方法可针对已知突变设计合适的引物，并选择性地扩增突变基因。