[发明专利]一种乌菜游离小孢子培养方法

权利要求书

1.一种乌菜游离小孢子培养方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

(1)选择游离小孢子培养胚状体诱导率较高的大白菜材料，与待培养的乌菜材料进行杂交，得杂交种子F1，为乌菜引入大白菜的遗传物质；

(2)将萌动的杂交种子F1低温春化后播种于穴盘，待3-4片真叶时，移栽至大田中，初花至盛花期，取适宜大小的花蕾进行游离小孢子培养，得再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种乌菜游离小孢子培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中游离小孢子培养步骤为：

取材：以F1作为材料，在初花至盛花期，于晴天上午8:00-10:00选取健壮无病虫害植株上的花蕾，置于载玻片上，滴2滴苏木精染液，用镊子和解剖针破碎花蕾，去除萼片、花药组织，盖上盖玻片，光学显微镜下观察单核靠边期小孢子，确定小孢子处于单核靠边期比例较高时花蕾的大小，以此大小为标准进行取材；

消毒：将选取的花蕾放入25mL无菌小烧杯中，首先用70％的酒精7-10mL消毒30s，其次用2.5％的NaClO溶液约10mL消毒5min，然后用无菌水冲洗3次；

小孢子纯化：消毒后，于上述小烧杯中加入蔗糖质量浓度为130g/L的B5无菌液体培养基约8mL，用玻璃棒轻轻挤压使小孢子游离出来，350目滤网过滤，收集滤液于15mL旋盖离心管中，转速1000rpm离心3min，弃上清，重复2次，最后加入蔗糖质量浓度为130g/L的NLN无菌液体培养基，使小孢子密度达到1×10⁵-2×10⁵个/mL，即获得小孢子悬浮液；

培养：将小孢子悬浮液分装于直径6cm的培养皿中，每皿约3.5mL，用Parafilm封口膜密封后，立即置于33℃黑暗条件下培养24h；然后，转入25℃黑暗条件下培养，有肉眼可见的胚出现时，将培养皿转移到转速60rpm的摇床上继续暗培养至形成子叶型胚状体；平均每个花蕾诱导出12.53个胚。

3.根据权利要求1所述的一种乌菜游离小孢子培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中再生植株成苗步骤为：

暗培养20d形成子叶型胚状体，挑选子叶型胚状体转接入添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂、pH5.8、116℃高温高压灭菌30min的MS培养基中，在25℃、光照14h/d条件下培养，形成再生植株；

将胚状体萌发形成的幼苗接种到添加30g/L蔗糖、6g/L琼脂、1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、pH5.8、116℃高温高压灭菌30min的MS生根培养基中，在25℃、光照14h/d条件下培养，获得完整植株，扩繁、驯化移栽至田间。