[发明专利]一种人原代肝细胞的分离及培养方法在审
| 申请号： | 201611032934.9 | 申请日： | 2016-11-15 |
| 公开（公告）号： | CN108070551A | 公开（公告）日： | 2018-05-25 |
| 发明（设计）人： | 不公告发明人 | 申请（专利权）人： | 江苏齐氏生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 214434 江苏省江阴市东盛*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 人原代肝细胞 预热的 针刺法 灌洗 混合酶液 细胞 完全培养基 结缔组织 染色检测 人肝细胞 人肝组织 无菌条件 细胞活性 细胞滤液 细胞形态 缓冲液 培养瓶 包被 放入 剪碎 切取 双抗 无菌 预冷 重悬 锥虫 成活率 洗涤 接种 密封 消化 血液 检测 新鲜 | ||
1.一种人原代肝细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌条件下切取新鲜人肝组织，4℃密封运回实验室；(2)将组织放入预冷无菌含双抗的PBS缓冲液中洗涤数次除去血液、结缔组织；(3)预热的PBS缓冲液针刺法灌洗；(4)预热的HBSS缓冲液针刺法灌洗；(5)预热的GBSS混合酶液针刺法灌洗；(6)剪碎组织用GBSS混合酶液消化，离心，弃上清；(7)取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；(8)细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5％CO
2.根据权利要求1所述的人肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(2)或(3)所用PBS缓冲液浓度为0.01M，PH为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的人肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(4)所用HBSS缓冲液含1％～5％的BSA，PH为7.2～7.4。
4.根据权利要求1所述的人肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所用GBSS混合酶液(PH为7.2～7.4)含0.1％～0.5％iv型胶原酶和0.1％～0.5％中性蛋白酶溶液，灌洗时间10～30min，灌洗量40-60ml。
5.根据权利要求1所述的人肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(8)所述的完全培养基为含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的双抗、4～6μg/ml胰岛素的H-DMEM培养基，pH为7.4。
6.根据权利要求1所述的人肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(8)所述的培养瓶用3～4μg/cm
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