[发明专利]一种稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的特异引物和检测方法与应用

权利要求书

1.一种稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的特异引物，其特征在于，所述特异引物的核苷酸序列为：

上游引物：5′-CTTGCAACAAGTTCGC-3′

下游引物：5′-CCATGATGTAGTGACACG-3′。

2.一种稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测方法，其特征在于，将权利要求1所述的引物与测稻纵卷叶螟样品的总DNA进行PCR扩增，反应结束后对PCR产物进行电泳分析，以确定稻纵卷叶螟样品是否感染病毒，具体包括以下步骤：

(1)引物合成：合成权利要求1所述特异引物的上下游引物；

(2)DNA模板提取：提取稻纵卷叶螟样品的总DNA；

(3)PCR扩增反应：以步骤(2)提取得到的总DNA为模板，以权利要求1所述的特异性引物为引物，进行PCR扩增反应；

(4)PCR产物分析：将步骤(3)中得到的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分析，检测判断PCR扩增产物中是否包括目标核苷酸序列，目标核苷酸序列为

CAATTGCAAC AAGTTCGCAT AAAAGCTGGT AATAAAAAAG CTTTTAAACA AATTAATTCG 60

ATTATACAAC CTGGACGTTT TGAAGTATTG TTTACTAATG TTGCAAAAAA ACCTTTAGAA 120

GAACAACAAC AACAACAACA ACAAGAAGAA GAAGAAAAGC AAAACAGTTT TACATGGATT 180

GAGTTGAGCG GACTAAAATC GTGTCACTAC ATCATAAC 218

如果PCR扩增产物检测到目标核苷酸序列，则说明待测稻纵卷叶螟样品感染稻纵卷叶螟颗粒体病毒；如果PCR扩增产物中没有检测到目标核苷酸序列，则说明待测稻纵卷叶螟样品没有感染稻纵卷叶螟颗粒体病毒。

3.根据权利要求2所述的稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应体系为50μl：10×PCR Buffer 5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μM/L的上游引物2.0μl，10μM/L的下游引物2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl₂ 3μl，去离子水补至50μl。

4.根据权利要求2所述的稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应条件为：

a：94℃预变性4min；

b：94℃变性30s，

c：52℃退火30s，

d：72℃延伸30s，b-d循环34个反应；

e：72℃延伸10min。