[发明专利]真菌基因定点插入突变的近原位回补方法

权利要求书

1.一种真菌基因定点插入突变的近原位回补方法，其特征在于：将靶标位点经过碱基更改但氨基酸序列不变的互补基因片段和U6启动子驱动携带抗性基因特异识别序列的sgRNA表达盒与根癌农杆菌T-质粒整合，构建以诺尔丝菌素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的病原真菌基因定点互补载体；用该互补载体转化病原真菌基因插入失活突变体的孢子，依赖突变体内所携带的Cas9对靶标位点进行切割,从而实现将互补基因片段准确插入突变体的抗性基因靶标位点；所述互补基因片段经In-fusion技术重组至带有携带抗性基因特异识别序列的sgRNA表达盒及gapd基因启动子驱动的诺尔丝菌素抗性基因的双元载体中，再由携带该双元载体的根癌农杆菌介导转化携带Cas9基因的插入失活突变体的孢子；所述突变体所携带的抗性基因为潮霉素抗性基因；所述病原真菌为甘蔗鞭黑穗菌；所述互补基因片段为mfa2、prf或g827基因；所述病原真菌基因插入失活突变体的孢子按以下方法制备：使用甘蔗鞭黑穗菌内源snRNA启动子驱动sgRNA表达盒，将CRISPR-Cas9系统与根癌农杆菌T-质粒整合，构建以潮霉素为抗性筛选标记的根癌农杆菌介导的甘蔗鞭黑穗菌基因定点插入载体失活系统；将目标基因的特异识别序列克隆入sgRNA表达盒，用于转化甘蔗鞭黑穗菌担孢子，从而将载体系统的可跳动DNA片段准确插入甘蔗鞭黑穗菌目标基因靶标序列；所述目标基因为甘蔗鞭黑穗菌JG35野生型菌株的mfa2、prf或g827基因；或者所述病原真菌基因插入失活突变体的孢子按以下方法制备：通过将甘蔗鞭黑穗菌内源U6基因启动子与所插入位点靶标序列以及sgRNA序列经Overlapping PCR融合后，经In-fusion技术重组至带有由甘蔗鞭黑穗菌内源gapd基因启动子驱动的Cas9基因及潮霉素抗性基因的双元载体中；再由携带该双元载体的根癌农杆菌介导转化甘蔗鞭黑穗菌从而达到对甘蔗鞭黑穗菌基因组的定点插入；所述甘蔗鞭黑穗菌u6基因启动子具有序列表SEQ.ID.No.17的碱基序列。