[发明专利]一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法

说明书

本发明公开了一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，步骤是：A、栝楼籽蛋白质提取：称取栝楼籽，倒入预冷研钵，在液氮中研磨成粉末；B、将粉末转入到离心管中，加入蛋白提取液；C、加入等体积的Tris‑饱和酚，冰浴，振荡，混匀；D、样品放入低温离心机，离心，取酚相，酚相收集到离心管中；E、向酚相中加入乙酸铵甲醇溶液，混匀，离心，弃上清，沉淀用乙酸铵甲醇溶液洗涤，获得蛋白质干粉；F、栝楼籽蛋白质电泳：得到的样本蛋白质干粉，加入等量的裂解液进行裂解后，采用Bradford法测定每个样本的蛋白质含量，进行考马斯亮蓝染色，并脱色，采集图像，对比蛋白胶特征条带，进行栝楼籽鉴定，该方法易行，操作简便，节省检测时间。

技术领域

本发明属于农业生物技术工程领域，更具体涉及一种采用蛋白质条带比对进行栝楼籽品种鉴定的方法，适用于栝楼籽品种鉴定。

背景技术

栝楼籽又名栝楼仁，为葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim.)或双边栝楼(Trichosan thes rosthornii Harms)的干燥成熟种籽。秋季采摘成熟果实，剖开，取出种籽，洗净，晒干。

栝楼籽具润肺化痰，滑肠通便之功效，用于燥咳痰粘，肠燥便秘。现在药理研究表明，它具有扩张冠状动脉，增加冠脉流量，保护缺血心肌，抗炎，抗肿瘤和泻下、抗血栓与动脉硬化、调节血糖等功效，具有较强的抗血小板凝集作用。栝楼籽的主要有效成分包括油脂和有机酸类、甾醇类和萜类、氨基酸和蛋白质以及微量元素和矿物质，可见栝楼籽具有较高的营养价值。近年休闲食品栝楼籽在大中城市得到普通认可，可作为常用大宗中药材和可口的炒食，每公斤售价达到60－80元，位于浏阳生物医药园的食品企业盐津铺籽加工栝楼籽，且销路很好，是天然的绿色休闲保健食品，产品在市场供不应求。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，通过采用蛋白质条带比对，操作简便，省时省力的鉴定，该方法易行，操作简便，节省检测时间。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法，其步骤是：

A、栝楼籽蛋白质提取：称取0.5g栝楼籽样本(去种皮)，倒入预冷研钵，在液氮中研磨成粉末(至少一百目，附：液氮研磨的鲜样是无法过筛的)，以研磨到奶粉状为宜。

B、将粉末转入到离心管中，加入2－4倍体积蛋白提取液，所述的蛋白质提取液为500mMTris，50MmEDTA,700mM蔗糖，100mMKCl,PH8.0，振荡28－32min，混匀。

C、加入等体积的Tris-饱和酚，冰浴，振荡28－32min，使之充分混匀。

D、样品(样品就是包括栝楼籽粉末以及蛋白质提取液，以及Tris-饱和酚溶液的离心管)放入低温离心机(eppendorf Centrifuge 5424R)4℃，12000rpm离心28－32min，取酚相(上层液)。余下的沉淀和液体再加入Tris-饱和酚，重复本步骤1－2次，酚相收集到同一离心管中。

E、向酚相中加入2－4倍体积的0.1M乙酸铵甲醇溶液，充分混匀，立即可见白色絮状沉淀，并在-20℃沉淀过夜后样品放入低温离心机(eppendorf Centrifuge 5424R)4℃，12000rpm离心28－32min，弃上清。沉淀用0.1M乙酸铵甲醇溶液洗涤4℃，12000rpm离心14－16min，弃上清，重复本步骤1－2次。沉淀用预冷丙酮洗涤4℃，12000rpm离心14－16min，弃上清，重复本步骤1－2次，将样品离心管敞口，室温(20－25℃，以下相同)下放置约28－32min，使丙酮挥发。最终得到的沉淀冷冻干燥后置-80℃下保存备用，获得蛋白质干粉。