[发明专利]一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法

说明书

本发明涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法，转基因家兔表达的EGFP标记家兔个体的全部细胞，在蓝色光激发下发出绿色荧光，这种显著的遗传标记的样本用于区分非标记样本。其构建方法是：将启动子优化的重组EGFP编码基因导入家兔受精卵中，获得EGFP转基因兔；对仔兔进行EGFP基因检测或绿色荧光检测，阳性为首建兔。首建兔与正常家兔杂交，可得到遗传稳定的EGFP转基因兔品系，建系的家兔组织和培养细胞均被激发出绿色荧光。本发明通过优化启动子序列，应用EGFP制作出了转基因家兔，EGFP标记的家兔可提供从宏观(个体)到微观(细胞)层次的直观可见的显著生物标记样本。

技术领域

本发明涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法，具体涉及通过显微注射构建出增强型绿色荧光蛋白转基因家兔，表达的增强型绿色荧光蛋白标记家兔个体的全部细胞，在蓝色光的激发条件下发射出绿色荧光。

背景技术

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一种在当今生命科学和医学研究中被广泛使用的示踪物，由GFP基因编码，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。基于GFP的光学成像技术使人们可以直接观察到从微观到宏观各个层次上丰富多彩的生命现象。

GFP由238个氨基酸组成，分子量为26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域(图1)。钱永健(RogerTs ien)在1995年完成GFP的单点突变。S65T突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488nm，而发射峰仍保持在509nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力，综上就产生了增强型GFP，也就是我们常见的EGFP(enhanced green fluorescentprotein)。

GFP已被广泛用于标记转基因动物，如小鼠、大鼠、山羊、牛猪等。2000年在法国已制备出GFP的转基因家兔，但迄今尚未有制备出EGFP转基因家兔的报道。与GFP相比EGFP荧光强度和光稳定性增强，更适用于活体标记；但较强的EGFP表达会影响胚胎的早期发育，降低转基因动物出生率，甚至不能得到转基因动物。因此，增强型绿色荧光蛋白转基因动物的构建仍有待研究。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法，其具有显著的遗传标记，用于区分非标记样本(包括家兔个体、组织和细胞)

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔，表达的EGFP标记家兔个体的全部细胞，在蓝色光激发下发出绿色荧光。

所述的转基因家兔由下述方法构建得到：

将重组EGFP编码基因导入家兔受精卵中，获得EGFP转基因兔；所述重组EGFP编码基因是pCAG-GFP质粒通过SnaBI+HindIII双酶切得到的2.8kb DNA片段；对仔兔进行EGFP基因鉴定或绿色荧光检测，阳性为首建兔。

首建兔与正常家兔杂交，得到遗传稳定的EGFP转基因兔品系，建系的家兔组织和培养细胞均被激发出绿色荧光。

本发明还公开了用上述的转基因家兔构建EGFP转基因兔品系的方法，是将上述获得的首建兔与正常家兔杂交，得到遗传稳定的EGFP转基因兔品系，建系的家兔组织和培养细胞均被激发出绿色荧光。

本发明通过优化启动子序列，应用EGFP制作出了转基因家兔，EGFP标记的家兔可提供从宏观(个体)到微观(细胞)层次的直观可见的显著生物标记样本。