[发明专利]一种构建组织工程角膜缘的方法

权利要求书

1.一种构建组织工程角膜缘的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质置于添加了去垢剂和核酸酶的脱细胞角膜缘保护液中进行震荡脱细胞处理；

(2)将所述脱细胞后的角膜缘置于脱细胞角膜缘保护液中漂洗，得到脱细胞角膜缘；

(3)将种子细胞接种在所述脱细胞角膜缘上进行体外扩增，行气液界面培养，当种子细胞在脱细胞角膜缘上扩增达到3～5层时，得到组织工程角膜缘；

其中，所述脱细胞角膜缘保护液为含有5～12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS缓冲液；

所述种子细胞为口腔黏膜上皮细胞和/或干细胞、或hES分化的角膜上皮细胞和/或干细胞；所述种子细胞接种到所述脱细胞角膜缘上的细胞密度为1～5×10⁴/cm²；

所述种子细胞体外扩增的条件为：条件培养基，扩增温度为37℃，CO₂体积浓度为5％，静置培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱细胞角膜缘保护液的pH值为7.2～7.4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述脱细胞角膜缘保护液的渗透压为300～400mOsm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去垢剂包括Triton、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠中的一种或多种。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述去垢剂在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度为0.2～0.5％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度为100～2000U/ml。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述震荡脱细胞处理的条件为：转速100～150转/分钟，温度20～30℃，时间2～4小时。