[发明专利]表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系，其为导入携带有山羊SLAM基因的真核表达载体的Vero‑E6细胞系。本发明成功构建了表达小反刍兽疫病毒的山羊SLAM受体的Vero‑E6细胞系，接种小反刍兽疫病料后，可在48h出现明显细胞病变。该细胞系不但可用于小反刍兽疫病毒的分离和鉴定，还能够有效缩短分离病毒的时间，并可提高病毒的产量，有望应用于大规模生产疫苗。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(pestedes petits ruminants virus，PPRV)引起的一种严重的烈性、接触性传染病，特征为发热、口腔及舌黏膜糜烂、流泪、流鼻涕、腹泻和肺炎。该病是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物疫病，我国将其列入一类动物疫病。2013年12月新疆暴发小反刍兽疫以来，我国各地相继出现小反刍兽疫疫情，因此PPR防控显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法。

本发明的另一目的是提供所述能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系在小反刍兽疫病毒的分离及其疫苗生产中的应用。

为了便于研究淋巴细胞活化分子(SLAM)在Vero-E6细胞膜上的表达及其在分离病毒中的作用机制，本发明利用pDisplay载体使SLAM基因与其含有鼠Igk引导序列的基因形成融合基因，pDisplay载体大小为5.3kb，能在哺乳动物细胞表面表达蛋白，能稳定准确地在细胞表面表达所需的目的蛋白，因此表达的重组蛋白组成几乎与原蛋白一致。此外，利用pDisplay载体的G418抗性，筛选培养出转染重组pDisplay载体的细胞株。G418是一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中常被用作选择性标记基因抗性筛选。它对原核细胞和真核细胞均具有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等。当neo基因被整合进真核细胞DNA后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物的高效表达，使细胞获得抗性而能在含G418的选择性培养基中生长，与阳性细胞克隆的筛选有着直接的关系。G418这一选择特性，已在基因转移、抗性筛选等方面得以广泛应用。并且，由于该载体N-端带有禽流感病毒HA标签蛋白，可用于阳性细胞系的筛选。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重组质粒pDisplay-gSLAM，所述重组质粒是携带有山羊SLAM基因的真核表达载体pDisplay。其中，所述山羊SLAM基因插入到载体pDisplay的Sma I和Sac II酶切位点之间。

本发明还提供能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系gSLAM/Vero-E6，其为导入携带有山羊SLAM基因的真核表达载体的Vero-E6细胞系(或BHK-21细胞系)。

所述携带有山羊SLAM基因的表达载体为上述重组质粒pDisplay-gSLAM。

本发明中涉及的山羊SLAM基因，其GenBank登录号为NM_204596。

本发明还提供所述细胞系gSLAM/Vero-E6的构建方法，包括Vero-E6细胞的转染、细胞阳性克隆的筛选及鉴定等步骤。用含G418的DMEM培养基筛选细胞阳性克隆，并通过间接免疫荧光法和/或Western blot法进行阳性克隆的鉴定。

在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞系的构建方法，包括以下步骤：

⑴山羊外周血淋巴细胞的分离

无菌颈静脉采集山羊抗凝血，使用红细胞裂解液，按说明书操作分离得到外周血淋巴细胞；

⑵山羊SLAM基因PCR扩增