[发明专利]一种牛口蹄疫3ABC抗体化学发光检测试剂盒

说明书

一种牛口蹄疫3ABC抗体化学发光检测试剂盒，属免疫学检测领域，所述检测试剂盒包含96孔化学发光免疫分析板、酶标抗体、血清稀释液、化学发光底物、化学发光增强剂和PBST洗涤液，其中所述96孔化学发光免疫分析板包被3ABC融合蛋白；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记兔抗牛lgG抗体；血清稀释液包含0.01% Tween‑20、1%酪蛋白、10%马血清和1%大肠杆菌；所述化学发光底物为鲁米诺溶液；所述化学发光增强剂含有IPP、H₂O₂和Tween‑20。本发明所述试剂盒相对于市售试剂盒产品，敏感性更高，特异性更强，诊断能力亦优于其他产品。

技术领域

本发明属于免疫学检测领域，具体地涉及一种牛口蹄疫3ABC抗体化学发光检测试剂盒。

背景技术

口蹄疫是一种古老的政治经济病，它严重威胁畜牧业的健康发展与进出口贸易。口蹄疫早期、准确的诊断对于防控口蹄疫的大流行来说无疑是至关重要的。因此开发快速、敏感、准确的诊断口蹄疫的方法是目前研究的热点。目前为止，世界卫生组织（OIE）所提到的关于诊断口蹄疫的方法主要有：病毒分离实验、病毒中和实验、补体结合实验、各种酶联免疫分析（ELISA）以及实时定量PCR等。然而，这些方法都有很多缺点难以克服。例如：病毒分离实验需要接触活毒，容易造成病毒泄露的危险。病毒中和实验完全不能区分疫苗免疫动物与野毒感染动物。补体结合实验敏感性低，已经不再使用。实时定量PCR耗时长需要专业人员与仪器进行检测。目前，用于诊断口蹄疫最普遍，最常用的方法是ELISA方法。由于口蹄疫实行普遍疫苗免疫政策，而现有灭活疫苗中不含有或含有少量口蹄疫非结构蛋白，所以检测口蹄疫非结构蛋白的抗原或抗体成为了区分疫苗免疫与野毒感染的重要手段。市场上有许多商品化的检测3ABC、2B、3AB等非结构蛋白的ELISA试剂盒。其中检测3ABC蛋白被普遍认为是确定口蹄疫感染的金标准。

现代免疫诊断技术发展迅速，自放射性免疫问世以来便开创了检测微量物质的先河，但放射性免疫产生放射性污染，因此在此基础上出现了酶联免疫，ELISA敏感性较低，在ELISA的基础上出现了化学发光免疫分析技术（CLIA）。相比于ELISA，CLIA是通过化学反应能量的转移产生发光。因此CLIA消除了背景荧光信号，具有极高的敏感性，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物。但是截至目前，关于区分口蹄疫疫苗免疫动物和野毒感染动物的化学发光免疫分析方法还未见报道。

发明内容

针对口蹄疫病毒检测所面临的问题，本发明拟提供一种牛口蹄疫3ABC抗体化学发光检测试剂盒，该试剂盒诊断的敏感性最高可达97.38%，诊断的特异性最高可达94.32%；通过对已知背景的血清样品进行检测，本发明所述试剂盒相对市售ELISA试剂盒都具有较高的符合率，说明诊断能力相对较高。

一种牛口蹄疫3ABC抗体化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含96孔化学发光免疫分析板、酶标抗体、血清稀释液、化学发光底物、化学发光增强剂和PBST洗涤液；所述96孔化学发光免疫分析板包被3ABC融合蛋白，所述3ABC融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛lgG抗体；所述血清稀释液为pH=7.2~7.4且摩尔浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，其中包含体积分数为 0.01% 的Tween-20、质量体积百分数为1%的酪蛋白、体积分数为10%的马血清和体积分数为1%的大肠杆菌裂解液；所述化学发光底物为0.1mmol/L 的鲁米诺溶液；所述化学发光增强剂包含0.07 mmol/L的IPP、3mmol/L的H₂O₂和体积百分比浓度为0.002%的Tween-20；

所述3ABC融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、利用基因定点突变技术，获取突变后的3ABC基因，使其编码的3ABC蛋白中3C蛋白上的第46位组氨酸突变成酪氨酸和第163位半胱氨酸突变成甘氨酸；所述3ABC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；