[发明专利]一种热稳定性提高的脂肪酶突变体

说明书

本发明提供了一种褶皱假丝酵母脂肪酶突变体，采用定点突变技术对褶皱假丝酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(CRL1)进行热稳定性改造以优化其在工业高温环境下的实用性。本发明以CRL1基因为模板，利用蛋白质理性设计技术，通过将CRL1脂肪酶基因序列编码氨基酸第457位的氨基酸由Asp替换成Phe，而获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，提高了该酶的应用范围与催化效率。运用分子生物学方法对CRL1进行定点突变，获得脂肪酶突变体，脂肪酶突变体的Tm值提高9.4℃，最适温度提高10℃，T_1/2(50℃)是亲本脂肪酶的6.5倍。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种热稳定性提高的脂肪酶突变体以及脂肪酶基因。

背景技术

酶作为一种天然的生物催化剂，具有反应条件温和、催化效率高、底物选择特异性高等传统催化方法所不可比拟的优点，在工业生产中具有巨大的应用潜力和良好的发展前景，但工业生产中常常需要较高的反应温度，一方面，高温条件下进行反应能够显著地降低反应物被微生物污染的概率，同时还可以增加底物的溶解性，使底物与酶更易接触；另一方面，一般而言，反应温度每增加10℃，反应速率就会提高两倍。因此，如果酶在高温下能够保持稳定的催化活力，就能随着反应速率的增加，缩短相应的转化时间，继而减少在反应过程中的需酶量，从而降低生产成本。大多数的酶蛋白分离于常温菌，这些酶蛋白经过长期的自然选择，已充分适应了生物体的催化要求，通常只能在较为温和的环境下发挥作用，这使得酶在其热稳定性上具有一定的局限性，过高的温度会影响蛋白质的稳定性，甚至导致其完全变性而丧失活力，使酶不能在工业条件下最大程度的发挥其作用，这严重制约了它们在工业生产中的应用。因此，建立一套高效的改良方法来提高酶的热稳定性是一件刻不容缓的事情。

褶皱假丝酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(Candida Rugosa Lipase 1，CRL1)与其他七种同工酶相比有着更高的表达量和水解、转酯、酯化活力，同时，由于其独特的催化性质(如立体选择性等)现已被广泛地应用于生物医药(手性拆分)、食品、生物柴油等多个领域中。但CRL1作为一种常温酶，具有较差的热稳定性，这一不足严重制约了其工业化应用。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，由亲本褶皱假丝酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(Candida Rugosa Lipase 1,CRL1)进行定点突变，获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，亲本CRL1氨基酸序列在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸/位置/替换氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为Asp457Phe，以解决现有技术的褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1(CRL1)热稳定性差的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，所述脂肪酶突变体为亲本褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1的氨基酸序列在氨基酸取代位置发生突变的突变体，采用“原始氨基酸/位置/替换氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为Asp457Phe。

优选地，所述脂肪酶突变体的序列为：

(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

优选地，用于表达所述脂肪酶突变体的表达载体为pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα或pPICZ。

优选地，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。