[发明专利]农杆菌介导的耐盐椒样薄荷茎段转化系统

说明书

本发明公开了农杆菌介导的耐盐椒样薄荷茎段转化系统。本发明涉及一种利用农杆菌转化耐盐椒样薄荷茎段获得转基因植株的方法，所述方法包括以下步骤：(1)椒样薄荷茎段预培养，(2)农杆菌介导的外源基因转化，(3)共培养，(4)丛生芽再生与抗生素筛选，(5)生根诱导和阳性植株检测。本发明是一种可以运用于椒样薄荷基因转化的体系，适用于多种植物表达载体的转化，容易获得再生植株。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及农杆菌介导的耐盐椒样薄荷茎段转化系统。

背景技术

椒样薄荷(Mentha piperita L.)是唇形科薄荷属多年生草本植物，别名欧洲薄荷、胡椒薄荷、黑薄荷，系水薄荷(Mentha aquatica)和绿薄荷(Mentha spicata)杂交而成的六倍体不育系，至今已有250年。原产于欧洲，我国20世纪开始引进，目前在新疆和陕西有小规模种植。椒样薄荷作为广泛种植的精油作物之一，薄荷精油为其最主要产品，主要含薄荷酮、薄荷醇、乙酸薄荷酯等118种成分，香气纯正，清爽宜人，广泛用于日用化妆品、医药和食品行业。

山东省应用微生物重点实验室筛选出1种可在黄河三角洲地区大规模推广种植耐盐椒样薄荷，并经过品种审定命名为“科院1号”。该耐盐椒样薄荷能够耐受0.8％NaCl胁迫，并具有很好的脱盐效果。

农杆菌(Agrobacterium)是一类生活在植物根的表面，依靠根组织渗透出来的营养物质生存的，普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。农杆菌具有天然感染植物细胞的能力，可以诱发植物冠瘿瘤。农杆菌中存在一种巨大质粒，称为Ti质粒。Ti质粒可以作为外源基因的载体，介导外源基因的转化。目前农杆菌介导的遗传转化已经广泛应用于双子叶植物和单子叶植物中，应用的农杆菌主要为根癌农杆菌和发根农杆菌两种。

农杆菌转化的方法主要有整体植株接种共感染法和叶盘转化法。叶盘转化法是由Horsch等发展起来的一种转化方法，其操作方法是首先用打孔器从消毒叶片上取得叶圆片，亦称之叶盘。后来这一共培养系统被广泛用于愈伤组织、细胞、悬浮培养细胞、茎切段、子叶切片、下胚轴切段等离体材料的转化。目前，椒样薄荷的农杆菌转化多采用的是叶盘法，外植体主要为叶片。本研究室对获得的耐盐椒样薄荷的体外再生体系进行研究发现，以叶片作为外植体建立再生体系比较困难，叶片容易褐化且分化效率较低。

发明内容

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供农杆菌介导的耐盐椒样薄荷茎段转化系统，具体为种使用耐盐椒样薄荷含芽茎段为外植体的外源基因转化方法。相较于叶片含有腋芽的茎段分化和获得再生植株都较容易，可以用来作为农杆菌介导转化的外植体。

本发明的农杆菌介导的耐盐椒样薄荷茎段转化系统技术方案为，步骤包括：

(1)耐盐椒样薄荷茎段预培养；

(2)农杆菌介导的外源基因转化；

(3)共培养；

(4)丛生芽再生与抗生素筛选；

(5)生根诱导和阳性植株检测。

步骤(1)所用耐盐椒样薄荷茎段为含腋芽茎段，并用无菌刀片在腋芽处轻轻划几刀，使其具有损伤易于转化和丛生芽分化，然后将茎段放入预培养的培养基中黑暗条件下预培养3天。

预培养所用培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

步骤(2)农杆菌介导的外源基因转化的方法是：将预培养的耐盐椒样薄荷茎段置于用转化液重悬的农杆菌菌液中，菌液调整OD₆₀₀为0.6-0.8，抽真空10-15min，然后黑暗条件下30℃，200r/min震荡培养30min。