[发明专利]新型葡萄糖氧化酶突变体

说明书

本发明涉及基因改造技术领域，具体提供了一种葡萄糖氧化酶突变体。所述葡萄糖氧化酶单点突变体的耐热性普遍高于野生型，60℃处理10 min后残余酶活提高了17.5‑72.7%，65℃处理5 min后残余酶活提高了23.8‑100.4%。从而说明上述单点突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，比野生型更适合用作饲料添加剂，有利于葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用，因而市场前景广阔。

技术领域

本发明属于基因改造技术领域，具体涉及一种新型葡萄糖氧化酶突变体。

背景技术

葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统，在分子氧存在下氧化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶将过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶对β-D-吡喃葡萄糖表现出强烈的特异性，葡萄糖分子C1上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于β位时要比在α位时高160倍。葡萄糖氧化酶对L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡萄糖完全没有活性。

由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域，我国医院普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，工业上主要利用黑曲霉菌或青霉菌进行生产，但是常出现酶活力不高、稳定性差、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80～90℃的高温阶段。而黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶热稳定性较差，其水溶液在65℃下保温5分钟剩余酶活性低于40％，使该酶在颗粒饲料的应用受到限制。目前采用饲料制粒后将葡萄糖氧化酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且无法保证酶制剂的稳定性以及酶制剂在饲料中的分布均一性。因此，提高葡萄糖氧化酶热稳定性对目前饲料用葡萄糖氧化酶具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的序列；

(Ⅱ)具有所述(Ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

(Ⅲ)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；

在本发明的另一些实施例中，所述取代为取代1个氨基酸。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第14，16，18，32，52，82，84，117，122，127，132，134，135，136，146，149，160，161，165，168，169，171，176，185，189位氨基酸中任意一个发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括第14位氨基酸由S变为A,或D。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括第16位氨基酸由R变为D。