[发明专利]一种斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法

权利要求书

1.斑重唇鱼线粒体基因组全序列扩增方法，其特征在于，具体步骤如下：

（一）斑重唇鱼线粒体Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四个基因片段的扩增；

（二）斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增；

步骤（一）斑重唇鱼线粒体Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四个基因片段的扩增，具体包括以下几个步骤：

（1）用于扩增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四个基因片段引物的筛选，选取了扩增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四个基因的引物分别为：

Cyt b：上游引物为5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物为5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；

COI：上游引物为5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物为5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；

ND4：上游引物为5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物为5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；

16S rRNA：上游引物为5’-CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT-3’，下游引物为5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’；

（2）四个基因片段扩增的PCR反应：反应总体系为50 μL，其中10×buffer 5.0 μL，Mg²⁺终浓度为2.0 mM，2.5 mM 的dNTP4 μL，Taq聚合酶2 units，10 μM的引物各2 μL，斑重唇鱼基因组DNA 2 μL，加灭菌水至终体积50 μL；

PCR反应条件为：95℃预变性5 min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45 s，退火45 s，其中各个 基因片段的退火温度为：Cyt b和16S rRNA 为57℃、COI为54℃、ND4为56℃，72℃延伸1 min，最后72℃再延伸10 min；

（3）琼脂糖凝胶电泳检测：称量0.7 g琼脂糖加入70 mL 1×TAE缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热至琼脂粉完全溶解且无泡沫，冷却至50-60℃加入7 μL核酸染料Gelview，轻轻摇匀避免产生气泡；待冷却至不烫手时将胶缓缓倒入胶槽内，待琼脂糖凝胶完全凝固后竖直拔掉梳子，将2 μL斑重唇鱼DNA样本与0.5 μL 6×DNA loading buffer混合后依次上样，最后点上6μL DL2000 Marker后开始电泳；电泳电压设定为120V，电流400mA，时间30 min；电泳完毕在凝胶成像系统照相，通过调节光圈和曝光时间，选择合适的滤光片，得到成像清晰、背景较低的照片；

步骤（二）所述的斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增，包括以下几个步骤：

（1）斑重唇鱼线粒体基因组的LA-PCR扩增引物的设计：以获得的Cyt b、COI、ND4和16SrRNA四个基因序列片段为模板，在其两端分别设计4对LA-PCR引物，用于扩增斑重唇鱼线粒体基因组剩余部分序列；

以16S rRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的环形区域设计第一对引物P1，上游引物为5’-GCAACAAGACCAAGTAGAACCCAC-3’，下游引物为5’-CAGGATTGATGATACACCCGCTAG-3’；

以COI基因片段为起点、ND4基因片段为终点的环形区域设计第二对引物P2，上游引物为5’-ATTGGAGCCCCAGACATAGCATTC-3’，下游引物为5’-AGCACAAGGAAGCCTCGGACTTTA-3’；

以ND4基因片段为起点、Cyt b基因片段为终点的环形区域设计第三对引物P3，上游引物为5’-CGCTGCGGTATGGTGATTCGT-3’，下游引物为5’- ATGATGCTCCGTTGGCGTGTA-3’；

以Cyt b基因片段为起点、16S rRNA基因片段为终点的环形区域设计第四对引物P4，上游引物为5’-TGACCTACCAGCACCATCCAACAT-3’，下游引物为5’-GACAGTTAAGCCCTCGTTTAGCCA-3’；

（2）根据设计的4对LA-PCR引物扩增斑重唇鱼线粒体基因组全序列，使用LA Taq聚合酶；

LA-PCR反应：反应总体系为50μL，其中10×LA PCR buffer II 5.0 μL，Mg²⁺终浓度为2.0 mM，2.5 mM 的dNTP8 μL，LA Taq聚合酶2 units，20 μM的引物各1 μL，50 ng/μL的斑重唇鱼基因组DNA 2.5 ng，加灭菌水至终体积50 μL；

LA-PCR反应条件为：95℃预变性2 min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性30 s，退火30 s ，其中各个引物的退火温度为：P1为57℃、P2为60℃、P3为58℃、P4为59℃，P1-P472℃延伸的时间分别为4、6、3、5min，最后72℃再延伸10 min；

4对LA-PCR引物扩增分别获得目的序列片段长度分别为4kb、6kb、3.1kb和4.5kb；

（3）采用引物步移法，分别以扩增的4个大片段序列为模板，每隔500 bp，设计一条测序引物对其进行分段扩增，28条测序引物序列信息如下：

以16S rRNA基因片段为起点、COI基因片段为终点的环形区域6条测序引物为：

5’-TCAACGAACCAAGTTACCCT-3’

5’-TACGGGCTTCTACAACCTAT-3’

5’-GCCCCTTCGCACTATTTTTC-3’

5’-GGAACCACTTTGACTTTTGC-3’

5’-CCACCTTACACTGCTTGCCC-3’

5’-GTGAAAATCTTCTAGCCCCT-3’

以COI基因片段为起点、ND4基因片段为终点的环形区域10条测序引物为：

5’-CGGCAAAAAAGAACCATTCG-3’

5’-GCCTATGCCCTATGAAACAC-3’

5’-GTGAACTATTTTACCAGCCG-3’

5’-AAAGATTGGTGCCTCCCGAC-3’

5’-CCGTGATTATTGGAATGCGA-3’

5’-CGTGACATTATCCGAGAAGG-3’

5’-CCACTTTACATCTGACCACC-3’

5’-AGGGAGTTAGTCCAAAGCAA-3’

5’-CACCCCTCTTTTAGTGCTCT-3’

5’-TAGCAGCGGTCCTACTAAAG-3’

以ND4基因片段为起点、Cyt b基因片段为终点的环形区域5条测序引物为：

5’-CACCTCCCTCCTCGTAGTTT-3’

5’-TCGGGTAGGGGACATTGGAT-3’

5’-GTAAGATGGGAGGCTTGTTT-3’

5’-GGCTTCTTTCCCTCAACTAT-3’

5’-GCAAAGACTACCAACATTCC-3’

以Cyt b基因片段为起点、16S rRNA基因片段为终点的环形区域7条测序引物为：

5’-TTGGATTGAACTCGGACGCA-3’

5’-AAGCATCGGTCTTGTAATCC-3’

5’-CCAAAGCCAGGATTCTGAAC-3’

5’-GGCTCAAATACTGACTAAGG-3’

5’-GCTCTAACCCGACTTACACA-3’

5’-CCCGTCTAACCTCACCACTT-3’

5’-GTATGGGAGACAGAAAAGGT-3’。