[发明专利]一种基于微流控技术的仿生气血屏障模型的构建方法

说明书

本发明提供一种基于微流控芯片技术的仿生肺气血屏障模型构建方法，特别针对模拟构建肺气血屏障的主要细胞组成和基质的三维排布。该微流控芯片主要由由基质入口池，两个细胞入口池，废液池，细胞培养室，基质室组成。该方法主要有以下步骤：(1)芯片基质灌注；(2)芯片细胞接种及培养；(3)芯片气血屏障功能监测。基于该微流控芯片的肺气血屏障模型构建方法具有更接近于体内气血屏障组成和结构层次的特点，同时能够实现对细胞层位置的准确定位。

技术领域

本发明涉及将微流控芯片技术应用到肺部生理/病理研究的技术领域，具体涉及一种基于微流控技术的仿生气血屏障模型的构建方法。

背景技术

肺气血屏障(Air-Blood Barrier，ABB)，又称肺泡毛细血管屏障，是使肺泡与肺毛细血管紧密相连的组织结构,主要介导外界环境中的气体与毛细血管内的血流之间的气体交换。肺气血屏障主要由肺泡表面液体层、I型肺泡上皮细胞层、细胞外基质和毛细血管内皮细胞层构成。肺气血屏障的完整性对于维持肺脏正常气体交换、防止血液中物质返流入间质和肺泡腔等至关重要。体外构建肺气血屏障模型是开展肺部生理/病理相关机制研究的前提和基础。然而，目前的研究手段主要依赖于孔板和商品化的transwell小室，以静态二维细胞培养为基础。但这种方式与体内细胞所处的三维微环境完全不同，也难以反映体内肺气血屏障所包含的气液界面、多细胞空间排列、血液流动等复杂的三维组织结构与生物力学微环境。

微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其具有与细胞大小相匹配的微米尺寸构件，可在芯片微通道内进行多种细胞培养和流体刺激，构建与生理环境接近并具有时空分辨特点的三维微环境，已成为组织器官构建的重要创新技术。特别是微流控技术在多种微通道集成、流体界面形成及复杂细胞微环境模拟方面的功能特点，尤其适合于构建包含气液界面、细胞、基质和流体等多因素共同构成的肺气血屏障，是建立体外肺气血屏障研究体系的理想平台。该方面研究国内外尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的仿生气血屏障模型的构建方法，特别针对模拟构建肺气血屏障的主要细胞组成和基质的三维排布，该方法具有接近体内肺气血屏障细胞和基质组成的特点，同时能够实现对肺气血屏障细胞和基质成分的动态变化进行实时动态观察。

本发明提供了一种基于微流控芯片技术的屏障功能监测方法，监测的对象为两层细胞和基质成分共同构成的仿生气血屏障模型。

本发明提供的一种微流控芯片，该微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括血管内皮细胞入口池，细胞外基质入口池，肺泡上皮细胞入口池，废液池，血管内皮细胞培养室，肺泡上皮细胞培养室，基质室；

所述基质室两端为细胞外基质入口池，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个栅栏结构，基质室通过两边的栅栏结构与血管内皮细胞培养室和肺泡上皮细胞培养室连接；

所述血管内皮细胞培养室上连血管内皮细胞入口池，下连废液池；肺泡上皮细胞培养室上连肺泡上皮细胞入口池，下连废液池；

本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，血管内皮细胞培养室和肺泡上皮细胞培养室高度为200-1000μm，基质入口池和基质室高度为100-300μm。

本发明还提供了一种基于微流控芯片技术的肺气血屏障功能监测方法，方法过程如下：

(1)芯片基质灌注

采用matrigel工作液，用移液器将其加入基质入口池，每孔0.5-100μl；加PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育20-60min凝胶，促使matrigel由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，从血管内皮细胞入口池和肺泡上皮细胞入口池分别加入两种细胞的新鲜培养液；

(2)芯片细胞接种及培养