[发明专利]一种高效杂交抗菌肽LI及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效杂交抗菌肽LI及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽是动物抵御外源病原体的第一道防线。它不仅具有杀灭病原菌的功能，还可以抗真菌、病毒、寄生虫以及抗癌细胞等生物功能。抗菌肽具有独特的杀菌机制，使其成为最有前景的抗生素替代物。抗菌肽分子具有带正电荷的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸和组氨酸以及具有疏水残基的疏水性氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。带有静正电荷的抗菌肽与带负电荷细菌细胞膜相互静电吸引，抗菌肽靠近细菌细胞，疏水性残基探入菌体细胞的脂质双分子层，使菌体细胞膜形成微孔或孔状结构，致使细胞内物质外流，从而导致细菌死亡。目前阻碍抗菌肽应用于医学、化妆品、食品及畜牧等行业的原因有以下两个方面：一、抗菌肽的毒性。天然抗菌肽具有较高的细胞毒性。寻找一种提高抗菌肽细胞选择性的设计方法势在必行。抗菌肽的细胞选择性是指抗菌肽对病原细菌具有杀灭功能而对正常动物体细胞没有毒副作用，表现出对细胞的选择性杀灭作用。抗菌肽的治疗指数是评价其细胞选择性的关键性指标。二、抗菌肽的生产成本。目前抗菌肽的制备主要是化学方法和基因工程两种方法。化学方法生产抗菌肽合成精准，但产量少，成本高。基因工程生产抗菌肽的方法正在试验过程中，工程菌的筛选以及基因表达过程的条件控制一直是制约该方法生产抗菌肽的主要因素。盲目的使用基因工程的方法表达抗菌肽，没有对抗菌肽的结构和功能以及体外试验进行全面的摸索，导致表达得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血等细胞毒性。

抗菌肽分子量最小，种类繁多，结构复杂。目前，已经有多种方法来研究抗菌肽的结构与功能之间的关系，例如，对天然抗菌肽进行改造及全新设计抗菌肽等研究方法。

发明内容

基于以上不足之处，本发明提供一种高效杂交抗菌肽LI及其制备方法和应用，该抗菌活性高而细胞毒性低。

本发明所采用的技术如下：一种高效杂交抗菌肽LI，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、如上所述的一种高效杂交抗菌肽LI的制备方法包括如下步骤：

1)根据定点氨基酸片段截取方法，截取人源抗菌肽LL37第14-21位氨基酸残基和牛源抗菌肽Indolicidin第5-13氨基酸残基片段，将上述两个片段依次连接，获得LI抗菌肽；

2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂；将得到的肽树脂经过TFA切割后，初步得到多肽产品；然后经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。

2、如上所述的一种高效杂交抗菌肽LI，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。

本发明通过截取天然抗菌肽LL37第14-21位氨基酸残基(GlyLysGluPheLysArgIleVal)和Indolicidin(In13)的特征氨基酸残基片段(LysTrpProTrpTrpProTrpArgArg)，杂交设计得到全新抗菌肽LI(GlyLysGluPheLysArgIleValLysTrpProTrpTrpProTrpArgArg-NH₂)。抗菌肽LL37是由人源hCAP18蛋白衍生的α螺旋抗菌肽，具有广谱的抗细菌、真菌、病毒等生物活性。Indolicidin是来源于牛中性粒細胞的一种富含色氨酸和脯氨酸的13个氨基酸的小肽。色氨酸是疏水性氨基酸，可与细菌表明的磷脂发生疏水性作用，破坏细菌的磷脂膜，从而产生生物学活性。二者均具有一定的溶血细胞毒性。国内外还未见利用二者特征片段杂交来研究抗菌肽结构与功能关系的报道。通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，该抗菌活性高而细胞毒性低，发现LI不但对大肠杆菌、绿脓杆菌、鸡沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、八种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。因而，综合来看，LI是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为设计得到的抗菌肽的三维预测图；

图2为设计得到的抗菌肽的质谱图。

具体实施方式

下面根据说明书附图举例对本发明做进一步说明：

实施例1

人源抗菌肽LL37的氨基酸序列为：

牛源抗菌肽In13的氨基酸序列为：

Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg-NH2