[发明专利]一种肺炎克雷伯菌特异基因的应用

说明书

发明公开了一种肺炎克雷伯菌的特异基因的应用，该肺炎克雷伯菌特异基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；根据该基因设计检测肺炎克雷伯菌引物，应用于环介导等温扩增和聚合酶链式反应体系，其具有特异性良好、灵敏度较好、检测快速可靠、操作简单的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种肺炎克雷伯氏菌的特异基因的新用途，具体是将其应用于建立肺炎克雷伯菌检测技术方法中。

背景技术

肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）为革兰阴性杆菌，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。细菌具有荚膜，在肺泡内生长繁殖时，引起组织坏死、液化、形成单个或多发性脓肿。病变累及胸膜、心包时，可引起渗出性或脓性积液。病灶纤维组织增生活跃，易于机化；纤维素性胸腔积液可早期出现粘连。

肺炎克雷伯菌是临床分离及医院感染的重要致病菌之一，随着β-内酰胺类及氨基糖苷类等广谱抗菌素的广泛使用，细菌易产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和头孢菌素酶（AmpC酶）以及氨基糖苷类修饰酶（AMEs），对常用药物包括第三代头孢菌素和氨基糖苷类呈现出严重的多重耐药性。肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近期逐年增高，且多耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。因此，快速准确地检测出肺炎克雷伯菌就显得尤为重要。

目前临床应用的肺炎克雷伯菌的检测方法包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学检测方法等，但这些方法都存在一些缺陷。传统的检测方法主要采用细菌前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤，一般需4至7天，操作繁琐，费时耗力；免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低。随着分子生物学和生物信息学的发展，陆续发现了一些病原菌保守的核酸序列，在此基础上建立了众多的检测技术。其中主要有核酸探针检测技术、实时荧光PCR检测技术、LAMP和PCR技术，这些方法因其特异性强、灵敏度高、省时等特点已越来越多的被应用于微生物鉴定中。

本发明利用生物信息学寻找出肺炎克雷伯菌特异基因，并针对其设计特异引物，分别建立了PCR和LAMP两种肺炎克雷伯菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出肺炎克雷伯菌的目的。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种肺炎克雷伯菌的特异基因的新用途，即其在检测肺炎克雷伯菌中的应用，该肺炎克雷伯菌特异基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；本发明通过生物信息学手段获取用于鉴定肺炎克雷伯菌的基因，该基因为hypothetical protein，基因名KPHS_07150，Genbank登陆号为NC_016845.1（754461..754838），该基因为肺炎克雷伯菌特有，与其他物质无明显相似性，具有种间特异，种内共有的特性。

本发明另一目的是提供检测肺炎克雷伯菌引物，其包括引物B3、引物F3，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

本发明另一目的是提供检测肺炎克雷伯菌引物，其包括外游引物B3、外游引物F3、内游引物BIP、内游引物FIP，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

1、上述肺炎克雷伯菌特异基因，经由基于基因组的本地BLAST及筛选，并进行在线BLAST分析重确认而获得，为hypothetical protein，基因名KPHS_07150，Genbank登陆号为NC_016845.1（754461..754838）区段；

2、PCR技术的检测方法