[发明专利]一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法

说明书

本发明公开了一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，通过对CcARF18基因的克隆、生物信息学分析、不同激素处理下转录水平表达量测定、亚细胞定位和维管束形成相关基因转录水平表达分析，确定了CcARF18基因在山核桃嫁接成活中以转录因子的形式起到抑制下游基因表达的作用，同时有助于进一步揭示CcARF家族影响山核桃嫁接成活的作用机制和山核桃嫁接过程生长素信号传导机制。为提高嫁接成活率奠定基础，有助于解决山核桃园艺化栽培困难的问题。

【技术领域】

本发明涉及山核桃嫁接的技术领域，特别涉及一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法。

【背景技术】

植物嫁接是无性繁殖的重要途径，是有性繁殖不能维持品种特性的如苹果、梨、桃等树种的一种重要补充。植物嫁接实质是砧、穗愈伤组织的产生、对接、愈合、维管束桥的形成与维管束的分化。愈伤组织连接后，在一定部位形成维管束桥，这是嫁接是否成活的必要条件之一。同时，生长素是在植物嫁接过程中一种非常重要的激素，它在植物生长发育的各个阶段都起作用，生长素是维管束形成的关键因子。生长素通过与受体结合，活化生长素响应因子ARF等转录因子，从而促进生长素下游功能基因的表达。根据转录因子的不同，生长素基因分为两类，早期基因与晚期基因。早期基因包括Aux/IAA、GH3和SAUR等，而ARF会调节早期生长素基因的表达，它通过与早期基因启动子中的TGTCTC生长素响应元件相结合，从而调控基因的转录活化或抑制。

前期，在拟南芥中鉴定出23个ARF基因具有重要的功能，其中AtARF1、AtARF2、AtARF 3、AtARF 4、AtARF 5、AtARF 7和AtARF 19参与叶片的发育，AtARF1和AtARF2与叶形和叶片的寿命有关。AtARF3、AtARF7和AtARF19与叶的展开模式有关，AtARF10和AtARF16参与根和茎的分化。但是，在山核桃等木本植物中未见有关ARF的研究报道。山核桃是重要的经济植物，营养期长，树体高大，园艺化栽培困难。因此有必要通过克隆山核桃嫁接相关基因CcARF18的全长，并对其功能进行初步分析，进一步了解其对山核桃嫁接成活的调控机理，为提高嫁接成活率奠定基础。

【发明内容】

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其旨在解决现有技术中园艺化栽培困难，嫁接难度大，且目前对山核桃等木本植物中生长素响应因子ARF了解较少的技术问题。

为实现上述目的，本发明提出了一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，包括以下步骤：

A)材料准备：采用两种不同的激素：IAA 4mg/kg，NPA 0.3μg/l来处理山核桃嫁接苗，对照组采用清水处理，在嫁接后0d，3d，7d，14d采样，共36个不同样品，每个样品5个重复，取自不同组织，取样后立即用锡纸包好放入液氮灌，-70℃存放备用；

B)CcARF18基因克隆：

b1)山核桃叶片总RNA提取：利用CTAB+Trizol法提取山核桃叶片总RNA；

b2)cDNA合成：利用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链；

b3)CcARF18基因引物设计：根据前期转录组已测序获得的538bp CcARF18片段，设计三个扩增引物ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)；

b4)RACE扩增：PCR反应体系：UPM 3μl，特异性引物3μl，Primer STAR Max DNA聚合酶25μl，双蒸水16.5μl，3’RACE-Ready cDNA 3μl；RACE扩增的条件为：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃2min30s，共35个循环；最后72℃延伸5min，琼脂糖电泳检测，胶回收纯化获得约2000bp目的片段，测序验证；