[发明专利]黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物及其应用

权利要求书

1.黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：

F3: 5’- GGGGCTAACTGCTTGAACAG -3’，

B3: 5’- GGTGCCGTTGTACCTGTT -3’，

FIP: 5’- TGTGCGAAGCATCGTTGCCGGGTAACCAGATTGGTGCTGC -3’，

BIP: 5’- AGGCAAAACATCTCTGGCGAGCCCATTCTTGACGTGGCCTTA - 3’。

2.一种利用权利要求1所述引物进行黄瓜炭疽病菌LAMP检测的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA；

（2）LAMP反应体系的建立：LAMP检测反应体系为25 μL，以步骤（1）提取的DNA为模板，反应体系包括5 μM F3和B3各1.0 μL，40 μM FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 UBst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP反应条件：63.5 ℃温育60 min，85℃灭活5min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定：

采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green Ⅰ 1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性；

采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0 μL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。

3.如权利要求2所述的一种黄瓜炭疽病菌LAMP检测方法，其特征在于，所述的LAMP反应混合液由以下组分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100。

4.利用权利要求1所述的黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物在黄瓜炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。

5.利用权利要求2所述的黄瓜炭疽病菌LAMP检测方法在黄瓜炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。