[发明专利]基于颜色判定的环介导等温扩增(LAMP)技术检测雪松疫霉根腐病菌

说明书

本发明公开了一种基于颜色判定的环介导等温扩增（LAMP）技术检测雪松疫霉根腐病菌的分子检测方法及其引物，引物序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示。本发明的检测体系在62°C等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到雪松疫霉根腐病菌，且不需要复杂仪器，为雪松疫霉根腐病菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足对雪松疫霉根腐病菌的现场检测，适用于出入境植物和植物产品的检验检疫和病害的调查、快速诊断及监测等，对防止雪松疫霉根腐病菌传入我国具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。

技术领域

本发明涉及一种检测雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker etMibrath)的LAMP引物，以及利用所述引物检测雪松疫霉根腐病菌的分子检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

雪松疫霉根腐病菌是一用于种重要的毁灭性植物病原菌，可侵染美国扁柏Chamaecyparis lawsoniana(A.Murray bis)Parlatore引起严重的根腐病。病害最早于1923年在美国西雅图、华盛顿附近的观赏植物上有报道发生，直到1942年，病菌在美国俄勒冈州的威拉梅特谷被发现并命名，病菌造成俄勒冈州西北部和华盛顿西部观赏植物的严重经济损失，使极具价值的园艺栽培种几乎全部毁灭，随后病菌传入加拿大、法国，对当地观赏植物及林业贸易造成严重影响^[1]。由于该病害为害重、传播快，而防治根除又极为困难，该病原菌已引起欧盟等许多国家的高度重视，纷纷采取措施严防其传入。近年来，由于国际间苗木及其植物包装材料的调运日趋频繁，该病原菌极可能传入我国，一旦传入，将对我国农林业、生态环境等造成重大威胁。由于我国未有雪松疫霉根腐病菌发生的报道，国家质检总局于2007年将该病菌列入新修订的《进境植物检疫性有害生物名录》中。为了防止该病原菌传入我国，需要对其进行快速、准确地检测，因此针对雪松疫霉根腐病菌的检测我们进行了一系列的研究。

雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis TuckerMilbrath)又名侧生疫霉，隶属藻菌界(Chromista)，卵菌门(Oomycota)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，疫霉属(Phytophthora)，是一类重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范围均很广泛。病菌在V8培养基上生长速度较慢(2mm/d～4mm/d)，菌落平贴至中度的蓬松。最低生长温度为3℃，最适生长温度20℃，最高生长温度26℃。菌丝无隔、分枝多而短，无色，常见的是光滑的，偶尔也有粗糙的，长时间培养后会在培养基上形成一层薄膜。可产生菌丝膨大体，最终形成厚垣孢子，厚垣孢子棕褐色，直径22μm～77μm，平均40μm，无柄，单个生于孢子梗顶端。病菌孢子囊无乳突，丛生于孢囊梗上，卵圆形、倒卵形、倒梨形，20μm～60μm×12μm～20μm(平均26μm×15μm)，长宽比1.67～5:1，平均1.73:1，游动孢子有侧生双鞭毛，直径为10μm～12μm。病菌为同宗配合，雄器侧生，藏卵器球形、光滑，卵孢子满器、壁厚约6μm，直径28μm～46μm，平均40μm^[1]。

传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等，操作繁琐，耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰^[2]，随着分子生物学的发展，分子生物学技术已逐步应用到雪松疫霉根腐病菌的研究中。基于普通PCR的方法已经成功用于检测雪松疫霉根腐病菌^[3,4]，虽然普通PCR法在特异性和灵敏度上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时普通PCR方法依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。