[发明专利]一种枯草芽孢杆菌Z12及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用于进行蛋白表达的枯草芽孢杆菌及应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Z12(Bacillus subtilis Z12)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为12750。本发明中的菌株为可被高效转化并且蛋白分泌量大的枯草芽孢杆菌，可以作为枯草芽孢杆菌表达系统的原始菌株。其转化效率可达1.8×10⁶cfu/ug，单次电击可得到约2×10⁵个单菌落，转化效率非常高，可以满足建库等苛刻实验的需要。通过生化鉴定和分子鉴定确认该菌属于生物安全的枯草芽孢杆菌。并且该菌分泌能力强，是模式菌168的3倍以上。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用于进行蛋白表达的原始菌株--枯草芽孢杆菌Z12及应用。

背景技术

蛋白表达技术是现代生物学的核心技术之一，表达蛋白不仅可用于生物学研究，也可以提供商业化的蛋白制品，如重组疫苗、重组胰岛素、细胞因子等产品。目前常用的表达系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，但是它们都各有明显的优缺点。大肠杆菌表达系统研究最充分，有多种选择，最常用的是Novagen的pET表达系统，其利用噬菌体的T7RNA聚合酶可专一性地转录T7启动子后的目的基因。在最佳条件下，目的蛋白可以达到大肠杆菌总蛋白的50％以上。尽管具有表达效率高，培养成本低等优点，但是缺点也非常明显：蛋白容易形成包涵体，复性难度和成本较高；大肠杆菌不能对蛋白进行糖基化修饰；细胞壁含有脂多糖(内毒素)，不易完全去除。另外一个常用的表达系统是酵母表达系统，其具有表达量高，可诱导，蛋白分泌到胞外易于纯化，并且具有一定的翻译后修饰能力等优点，但是缺点是部分表达产物易降解，表达量不可控，大于30KDa的蛋白几乎不能分泌。昆虫细胞和动物细胞表达系统的特点是具有完整的修饰系统，表达产物具有或者类似的天然活性，没有内毒素污染，但是表达量低，周期长，技术要求高，生产成本高。

枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于水体、空气、土壤中的革兰氏阳性菌，其可以在环境不适宜的时候产生孢子，孢子可以抵御高温、干旱等极端环境，待环境适宜时再萌发进行营养生长。枯草芽孢杆菌的分泌能力强，在进行高密度发酵时，蛋白分泌量可以达到20—25g/L。其发酵生产的蛋白酶、淀粉酶、次黄嘌呤核苷、核糖甙等产品，早已经进入我们的日常生活。由于其具有生物安全性，被FDA评委GRAS类添加剂，其生产的益生菌及利用其生产的发酵产品已广泛应用于医药养殖业中。

上世纪八十年代就开始利用枯草芽孢杆菌进行蛋白表达，其表达产物不仅包括细菌来源的各种酶类，如淀粉酶、蛋白酶、内葡聚糖酶、脂肪酶等，还包括hEGF、IFN-alpha 2、Proinsulin、Streptavidin、cathelicidin-BF等不同来源的蛋白。利用枯草芽孢杆菌的分泌途径，可将表达蛋白分泌到发酵液中，极大地降低了后期分离纯化的难度。枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，不含有脂多糖，便于生产注射用药品。枯草芽孢杆菌的营养要求简单，由于其已经实现规模工业化生产，大规模培养技术难度低，培养成本低。目前，枯草芽孢杆菌中的多个菌株及芽孢杆菌属中的多个种都已经完成了基因组测序工作，遗传背景清楚，安全性高，也便于进行基因组改造。但是枯草芽孢杆菌表达系统并不是一个广泛应用的表达系统，还有许多缺点待克服。

枯草芽孢杆菌的模式菌168菌的野生型菌株已经丢失，目前可以得到的菌株都是其突变体。尽管其满足于科学研究的要求，但是其蛋白分泌能力差，是营养缺陷性突变体的特性，并不能满足建立商业化表达系统的要求。目前建立的表达系统都是基于模式菌株168建立的，尽管野生型来源的菌株和已经生产应用的枯草芽孢杆菌种非常多，不易转化都阻碍了对这些菌株的进一步改造。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供种枯草芽孢杆菌Z12，其具有转化效率高，蛋白分泌量大的特点。