[发明专利]重组脊髓灰质炎III型病毒样颗粒

说明书

本发明公开了一类密码子优化的编码III型野生型脊髓灰质炎病毒外壳前体蛋白的基因以及编码I型减毒脊髓灰质炎病毒3CD蛋白的基因，前述基因在被转入酵母细胞后利用共表达可高效地胞内自发组装成VLP颗粒。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子，其主要由前述基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了前述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。

技术领域

本发明涉一种新的毕赤酵母表达系统，其可用于生产脊髓灰质炎病毒III型病毒样颗粒。

背景技术

脊髓灰质炎是一种急性传染病，由脊髓灰质炎病毒引起，主要通过消化道传播。病毒常侵犯中枢神经系统，损害脊髓前角运动神经细胞，导致肢体松弛性麻痹，多见于儿童，又名小儿麻痹症。部分小孩得病后可以自行痊愈，但多数小孩患病后会出现下肢肌肉萎缩、畸形，结果引起终身残疾，多为跛行甚至根本不能站立、行走。目前针对这种疾病尚无有效的治疗方法，只能通过疫苗预防。

截止到2005年，全球范围内仍有6个国家存在脊灰野病毒的流行，其中与中国接壤的有3个，印度尼西亚、也门等一些已经消灭脊灰的国家相继发生了输入性脊灰野病毒传播，造成局部地区脊灰重新暴发流行。自2004年以来此类输入事件已在全球18个无脊灰国家重演。一旦条件适宜，脊灰野病毒仍可能卷土重来。2000年10月，世界卫生组织西太平洋地区宣布成为无脊髓灰质炎区域，标志着中国已达到无脊髓灰质炎目标。但这三个存在野毒株的邻国对中国构成输入性威胁，使我国的维持无脊灰工作面临严峻挑战。

口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral polio vaccine，OPV)在1958年研制成功在美国上市，后来推广至全球。OPV的接种简单(口服)、费用低、可产生稳定的肠道粘膜免疫、有效阻断脊灰病毒传播等。OPV的推广使脊髓灰质炎疫情得到了有效的控制，全球的小儿麻痹症发病率逐年下降。但每服用250万剂-1000万剂OPV，可能发生1例疫苗相关病例，包括疫苗相关麻痹型脊灰(Vaccine associated paralytic poliomyelitis，VAPP)病例，疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus，VDPV)及其所引起的疫苗衍生脊灰病毒的循环(Circulating vaccine-derived polioviruses，cVDPVs)和免疫缺陷疫苗衍生脊灰病毒(Immunodeficient related vaccine-derived poliovirus，iVDPV)病例。

IPV是通过用甲醛灭活的脊灰毒株生产的传统灭活疫苗(Conventionalinactivated poliovirus vaccine，cIPV)。国外研发的IPV使用野毒株灭活，其免疫原性和安全性都很理想，能有效预防脊灰爆发，并且IPV不存在引起VAPP、cVDPVs等风险，其群体免疫优于OPV。但是对技术及生产要求较高，价格昂贵。2015年我国上市的自主研发的IPV使用减毒株灭活，也同样具有很好的免疫原性及安全性。随着全世界消灭脊灰目标的推进，将会更加严格管理脊灰毒株，包括弱毒株及野毒株。所以新一代脊髓灰质炎疫苗的开发迫在眉睫。

脊髓灰质炎病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enteroviruse)，直径20～30nm，立体对称12面体。病毒颗粒中心为单股正链RNA，核衣壳体裸露无囊膜。脊髓灰质炎病毒基因组RNA长约7.5kb。基因组分为5′端非编码区、多聚蛋白编码区、3′端非编码区和3′端Poly(A)尾四部分。其中多聚蛋白编码区编码产生一个多聚蛋白前体，分为P1、P2和P3区；P1区可经蛋白酶水解产生衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，P2和P3区则可水解产生蛋白酶、RNA复制酶及用于识别细胞、调节基因的其他蛋白。核衣壳含4种结构蛋白VP1、VP3和由VP0分裂而成的VP2和VP4。VP1为主要的外露蛋白至少合2个表位(epitope)，可诱导中和抗体的产生，VP1对人体细胞膜上受体有特殊亲和力，与病毒的致病性和毒性有关。VP0分裂为VP2与VP4，为内在蛋白与RNA密切结合。VP2与VP3半暴露具抗原性。5个拷贝的VP1、VP2、VP3和VP4构成了五聚体，12个五聚体构成二十面体核壳。