[发明专利]用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

a、盖玻片的处理：

用等离子表面清洗机对盖玻片正反两面进行处理，然后将处理后的盖玻片浸泡于改性溶液中，放置一段时间，取出，溶剂淋洗，自然风干，备用；

b、聚合物涂层的制备：

将单体、交联剂、紫外光引发剂和溶剂按比例混合均匀，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再将步骤a得到的盖玻片盖在液滴上，轻轻挤压排出空气，紫外聚合，得到聚合物涂层；

步骤b中单体为：甲基丙烯酸羟乙酯A、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液E、甲基丙烯酸环己酯L、甲基丙烯酸-2-（二乙氨基）乙酯K，聚合物涂层为：E1K1L1、E3K1L2、E3A1L2，数字为各单体之间的质量比。

2. 根据权利要求1所述的用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法，其特征是：所述的步骤a中等离子表面清洗机功率500w，时间120s；盖玻片的规格为φ30mm；改性溶液包括乙腈、三乙胺和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，乙腈、三乙胺和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的体积比为60～61：0.4～0.42：0.85～0.87。

3.根据权利要求1所述的用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法，其特征是：所述的步骤a中处理后的盖玻片浸泡于改性溶液中，在恒温振荡器震荡24h后，取出盖玻片，用丙酮清洗2～3次，自然风干，保存在-25℃冰箱中待用。

4. 根据权利要求1所述的用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法，其特征是：所述的步骤b中交联剂为 N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，紫外光引发剂为1-羟环己基苯酮，溶剂为1-甲基-2-吡咯烷酮，单体固含量为50%，交联剂和紫外光引发剂分别占单体总质量的10%和5%，步骤b中聚合物溶液为10μL。

5. 根据权利要求1所述的用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的制备方法，其特征是：所述的步骤b中聚合物涂层具体制备方法为：用365 nm紫外光照射30 min后，将PET薄膜剥离，得到复合有聚合物涂层的载玻片，将载玻片放置在40℃烘箱中12 h，用丙酮和乙醇各冲洗两次，自然风干。

6.权利要求1中所述的用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的应用，其特征是：还包括：

c、人类脂肪干细胞在聚合物涂层上的长期培养：

收集人类脂肪干细胞消化并计数，接种到聚合物涂层表面进行长期体外培养；

d、诱导人类脂肪干细胞向成脂、成骨、成软骨细胞的分化：

待步骤c中的人类脂肪干细胞生长至80%融合时，分别更换成脂、成骨、成软骨诱导培养液，以加入L-DMEM培养基组作为阴性对照组于培养箱中培养；

e、对诱导后的三种成体细胞分别进行染色定性：

成脂、成骨、成软骨细胞诱导一段时间后分别进行油红O染色、茜素红染色、阿利新蓝染色，然后进行拍照观察。

7. 根据权利要求6所述的用于人类脂肪干细胞体外长期培养的聚合物涂层的应用，其特征是：所述的步骤c中聚合物涂层表面进行长期体外培养的具体操作为：收集第2代人类脂肪干细胞，将细胞浓度调整为1×10⁵个/mL，接种于载玻片的聚合物涂层上，载玻片置于6孔板中，每孔加2.5 mL细胞悬液，用一个没有聚合物涂层的TC板作为对照组；每3天换一次培养液，待对照组的细胞长到90%融合时，将所有实验组及对照组的细胞分别脱壁计数，仍按1×10⁵个 /mL的浓度分别接种于对应的聚合物涂层表面进行传代长期培养。