[发明专利]一种液质联用定量检测大鼠血浆中叶酸浓度的方法

说明书

本发明公开了一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法。首先采用蛋白沉淀处理大鼠血浆样本，以格列本脲为内标运用高效液相色谱‑质谱联用(HPLC‑MS/MS)方法检测大鼠血浆中叶酸的含量。质谱采集方法选用ESI正离子及多反应监测模式(MRM)。该方法叶酸在10～1000ng/ml线性关系良好。方法的回收率在80.0％～95.4％范围内；批内和批间的准确度为92.7％～111.4％，批内和批间精密度为2.6％～8.3％。该方法重现性好，分析时间短，能满足叶酸在大鼠血浆中浓度的检测要求，可用于叶酸片剂药代动力学研究。

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法。

背景技术

叶酸是由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成的水溶性维生素。叶酸在人体内主要参与嘌呤和嘧啶核苷酸的合成和转化，参与构成含铁的血红蛋白，参与蛋白质的代谢等，是细胞生长和繁殖所必需的物质。临床上可以用来预防神经管畸形，还可用于治疗慢性萎缩性胃炎、抑制支气管鳞状转化以及防治因高同型半胱氨酸血症引起的冠状动脉硬化症、心肌损伤与心肌梗塞等。研究表明，叶酸还能抑制肿瘤细胞中癌基因的表达，从而阻断恶性肿瘤的进展。目前叶酸在机体内的检测主要有微生物测定法、放射免疫测定法、色谱分析法等，这些方法都存在一定的局限性，而且也不能满足大批量样本的检测。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供了一种重现性好、灵敏度高、分析速度快的检测血浆中叶酸浓度的方法，此法可用于药代动力学研究，为其临床给药提供有益的参考。

一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法，包括步骤(1)样品制备，(2)采用液相色谱-质谱联用检测，(3)标准曲线制备，(4)血浆中叶酸浓度测定。

所述步骤(1)样品制备的步骤包括：取待测血浆样本，加入内标工作溶液沉淀蛋白，混匀后加超纯水混匀，低温离心，取上清液。

所述内标溶液中内标为格列本脲。

所述步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：

(a)液相色谱条件色谱柱：C18柱；流动相：0.1％甲酸-水(A)与乙腈(B)；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱梯度程序如下：0～0.5min，5％(v/v)B；2.2～3.2min，95％(v/v)B；3.21～6min，5％(v/v)B。

(b)质谱条件质谱采用Agilent 6430三重四极杆质谱仪，电喷雾正离子源，多反应监测分析模式(MRM)。

所述(a)液相色谱条件中，色谱柱为Thermo Accucore C18柱(50mm×2.1mm，2.6μm)，样品检测时间：6min；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：40℃。

所述(b)质谱条件中，干燥气：N₂；干燥气流速：10L/min，干燥气压力：40psi，干燥气温度：350℃，毛细管电压：4000V。MRM监测方法参数如下：定量离子对叶酸：[M+H]+m/z442.2/295.1，碎片电压：100V，碰撞能量：10eV；内标格列本脲：[M+H]+m/z 494.2/369.0，碎片电压：130V，碰撞能量：9eV。

所述(3)标准曲线制备的步骤包括：分别取100、250、500、1000、2500、5000、10000ng/ml的叶酸标准溶液10μl加入大鼠空白血浆90μl，涡旋得10、25、50、100、250、500、1000ng/ml的标准样本溶液，按步骤(1)样品制备的方法制备，取上清液按步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录每个浓度的叶酸对应的峰面积；以叶酸和内标的峰面积比值为纵坐标，以叶酸的浓度为横坐标X，制备叶酸的线性回归方程。