[发明专利]一种适用于牛BVDV、IBRV、PIV3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法

说明书

本发明公开了一种适用于牛BVDV、IBRV、PIV3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法。本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种针对牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞体病毒灭活疫苗的灭活检验方法，包括以下步骤：1）灭活后的病毒液在适宜细胞上吸附40‑60min，期间振摇2‑3次；2）吸附后，在细胞转瓶中加入一定体积的细胞维持液继续培养，观察细胞病变，对于无细胞病变的病毒液，收获细胞培养液，并冻融2‑3次；3）取冻融后的细胞培养液10‑15ml，接种于适宜细胞上吸附，继续培养。进行观察和荧光检测，如没有特异性荧光，则表明灭活完全。本发明中公开的技术方案保证了抗原浓度和病毒感染时间。经本发明灭活检验方法检验病毒的检出率高，可以有效确保灭活疫苗的生物安全。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种适用于牛病毒性腹泻（BVDV）、牛传染性鼻气管炎（IBRV）、牛副流感（PIV3）、牛呼吸道合胞体病毒病（BRSV）灭活疫苗的灭活检验方法，属于兽用医药生物领域。

背景技术

疫苗免疫是防控疫病的重要手段，按疫苗中病原微生物是否存活，将疫苗分为灭活疫苗和活疫苗。灭活疫苗是将病原微生物用化学方法或物理方法使制造疫苗所用的微生物的活性、繁殖力或致病力消失，但仍保存相应抗原的免疫原性。

灭活检验是灭活苗制备过程中重要的工艺之一，是保证疫苗生物安全的重要措施，因此，有效的灭活检验方法对疫苗的安全应用具有重要的意义。当前，不同灭活疫苗根据病原的特性，具有不同的灭活检验方法，但其最根本的是要通过简便、快速确定是否灭活完全，以保证环境生物安全、疫苗不散毒。

由于不同灭活疫苗中病原的特性不同，因而需要根据病原的生长特点和灭活剂的特征设计形成不同的灭活检验方法。对于不同的病毒来说，方法没有迁移性和适用性。譬如猪圆环病毒灭活疫苗的灭活检验方法并不适用于牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的灭活检验。

发明内容

本发明的目的是设计一种适用于牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感、牛呼吸道合胞体病毒病灭活疫苗的灭活检验方法。

为了实现这一目的，本发明公开了一种灭活检验方法，包括以下步骤：

1）根据待检测的需要，选择适宜牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感或者牛呼吸道合胞体病毒适宜生长的细胞系进行复苏培养，其中可供选择的细胞系包括牛肾细胞系（MDBK细胞系）、牛睾丸细胞（BT细胞系）、牛鼻甲骨细胞系（BT细胞系）、Vero细胞系、BHK21细胞系、牛原代细胞、MDCK细胞系、牛子宫细胞系（NCL-1细胞系）、NCL-1细胞系、兔肾原代细胞（CRL-1414）、兔肾细胞（LLC-RK1）。

2）选用2个已长成良好细胞单层，密度达80%-90%的适宜体积的转瓶，弃去细胞培养液，取灭活后的病毒液20-30ml接种于细胞转瓶中，置37℃、含5%CO₂培养箱中，使灭活后的病毒液在前述适宜细胞上吸附40-60min，期间振摇2-3次；

3）吸附后，在细胞转瓶中加入一定体积的细胞维持液，将细胞转瓶置于37℃的CO₂培养箱中继续培养3-4日后，观察细胞病变，对于无细胞病变的病毒液，收获细胞培养液，并冻融2-3次；

4）取冻融后的细胞培养液10-15ml，接种于175cm²方瓶已生长至密度为80%-90% 的适宜细胞上吸附40-60min后，在细胞转瓶中加入营养维持液，将细胞瓶置于37℃的CO₂培养箱中继续培养3天，对于可出现细胞病变的病毒液，观察细胞病变，如无细胞病变，则表明灭活完全；