[发明专利]一种离体培养提高甜叶菊RA含量的方法

说明书

本发明公开了一种离体培养提高甜叶菊RA含量的方法，包括：将甜叶菊叶片接种到诱导愈伤组织的培养基上，产生愈伤组织后转入到分化培养基中，幼芽形成后转入到生根培养基中，长出根系后通过驯化移栽到温室内进行常规栽培管理。本发明属于细胞生物学和生物技术领域。本发明得出了快速获得RA含量高的甜叶菊植株的方法，提高了甜叶菊叶片RA的含量，口感更佳。

技术领域

本发明涉及甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)离体培养提高甜叶菊叶片中RA含量的方法，属于细胞生物学和生物领域。

背景技术

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)为菊科甜菊属多年生草本植物。甜叶菊原产南美巴拉圭地区，其叶片中含有甜菊糖苷(stevioside，ST)，其甜度为蔗糖的200-300倍，是天然的高甜度低能量型甜味物质。经现代科学证明，甜叶菊对高血压、糖尿病、动脉硬化、冠心病患者有较好的防治效果，喝甜菊茶，能帮助解除精神疲劳，促进新陈代谢，有益于人体健康，是现代安全保健糖料。目前，已有研究表明甜菊糖苷类物质有莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，RA)、RB、RC、RD、RE、RF、RM以及甜菊苷(Stevio Glycoside，SS)等多种化合物。甜菊糖苷的化学成分由双萜苷元(非糖体部分)和糖基(主要是葡萄糖)组成。甜菊糖苷的甜味和苦味是由人体舌头味觉细胞上的糖受体和苦味受体对甜菊糖苷中的非糖体和葡糖基所识别而感觉到。其中，甜味和苦味主要由非糖体部分和C13、C19位的R1和R2上的糖基数量决定。糖基多的甜菊糖苷RA比其他的甜菊糖苷味道更甜更接近蔗糖的甜度，而苦味较少。因此，培育高RA甜叶菊新品种对于进一步开拓甜菊糖作为甜味剂市场具有重要意义。

通过杂交育种培育高RA含量甜叶菊新品种和通过栽培提高甜叶菊RA含量都是可行的方案。已有研究表明，不同品种甜叶菊叶片RA含量有很大差异，如SR-2基因型甜叶菊ST含量达到12.87％，而RA含量仅为0.02％；而SR-3基因型甜叶菊的RA含量则达到了9.35％，ST含量只有1.23％；SR-3型甜叶菊具有更高的品质，同时SR-3甜叶菊叶片中的UGT76G1基因的表达量也远远高于SR-2。说明提高UGT76G 1基因等的表达量可以提高RA含量。也有研究表明，植物调节剂配合氮磷钾复合肥料(N∶P∶K＝15％∶15％∶20％)施肥，可以增加甜叶菊叶片RA含量11.6％，有机肥与化肥混合施用，可以提高甜叶菊叶片RA含量10％以上。说明通过高RA优良单株之间的杂交，或通过氮磷钾不同配比施肥的栽培均能不同程度地提高甜叶菊叶片RA含量。但杂交育种方法需要时间较长，而通过施肥提高的RA含量不能在下一代稳定遗传等，均有一定的局限性。

从甜叶菊生物合成途径角度分析，甜菊糖是由叶绿体内合成的贝壳杉烯，转运至内质网膜进而合成为甜菊醇，甜菊醇在液泡中合成为甜菊糖的各组分物质，甜菊醇在各种尿苷二磷酸糖基转移酶的作用下按步骤分别生成甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊糖苷及甜菊糖A苷(RA)，最终在液泡中大量积累储存。

另一方面，我们考虑到甜叶菊从叶片脱分化形成大量愈伤组织的过程中细胞内物质需要重新合成和分配。从上述RA生物合成途径角度可以推测，RA在细胞中的合成需要很多中间产物作为底物合成的，如果细胞内没有足够的RA生物合成前体物，那么外源提供RA也可能为细胞内的RA合成提供物质基础的。但是通过愈伤组织提高甜叶菊叶片RA含量的研究未见报道。因此，我们尝试通过组培过程中从开始诱导愈伤组织的培养基中添加外源RA，试图获得甜叶菊植株叶片中RA含量较高的株系。

发明内容

本发明的目的在于，快速获得RA含量高的甜叶菊植株，以解决上述问题。

本发明所解决的问题可以采用以下方案来解决：

一种快速获得RA含量高的甜叶菊植株方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用200mg/g RA添加到外植体为甜叶菊叶片的诱导愈伤组织培养基MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA中。