[发明专利]一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法

权利要求书

1.一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板；

所述液路控制层具体设置有下述结构：

——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；

——荧光染色进样通道区(P1)：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区(P2)之间用于沟通二者；

——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区(P2)中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区(P2)中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；

——细胞进样通道区(P2)：设置在荧光染色进样通道区(P1)和细胞培养室之间；

——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区(P2)和药物进样通道区(P3)之间；

——药物进样通道区(P3)：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；

——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；

——液体流出通道区(P4)：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口(13)之间；

——出液口(13)：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；

基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法具体要求如下：细胞荧光染色步骤如下：

①从各个药物进样口分别吸出药物溶液，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；

②从各个细胞进样口分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗2～5次，3～8min/次；

③从各个药物进样口分别吸去多聚甲醛，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；

④从各个细胞进样口分别加入表面活性剂Triton X-100覆盖细胞10min，增加细胞膜的通透性，磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；

⑤从各个细胞进样口分别加入血清封闭细胞15～60min；

⑥在抗体加入之前，打开分别控制各个细胞进样口的气阀和分别控制各个药物进样的气阀；

⑦打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，将骨桥蛋白一抗从细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道区(P1)加入细胞培养室，孵育过夜；关闭用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；

⑧次日，关闭控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口的气阀，将二抗从另一个细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道区(P1)加入细胞培养室，避光孵育0.5-3h；关闭前述用于引入二抗的细胞荧光染色进样口；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；

⑨关闭前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚从对应这一细胞荧光染色进样口入口引入并流经荧光染色进样通道区(P1)加入细胞培养室；之后关闭前述用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从对应的用于控制细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达；

所述集成化药物筛选与染色微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：

其一，细胞荧光染色进样口设置有四个，其具体分别为：一抗入口(1)、二抗入口(2)、细胞核染料入口(3)、PBS缓冲液入口(4)；所述集成化药物筛选与染色微流控芯片中设置有四个以前述四个细胞荧光染色进样口为入口的通道，其相互并联并最终汇成一个共用的通道；最终汇成的共用通道再次一分为四，变成四条各自设置有一个细胞进样口的四条通道，每个细胞进样口还分别依次连接着下游的细胞培养室、药物进样口和再之后的液体流出通道区(P4)；所述四个细胞进样口分别为：细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)；与前述四个细胞进样口依次对应处于同一液体通路上的四个细胞培养室分别是：细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)；同样的，对应的四个药物进样口分别依次是：药物进样口一(9)、药物进样口二(10)、药物进样口三(11)、药物进样口四(12)；

其二，液体流出通道区(P4)：其是将细胞培养室下游的四条通道合并为最终的共用的一个出液口(13)的通道合并区域；

其三，所述微流控芯片的下层即气路控制层具体由泵阀控制区组成，每个荧光染色液体入口有单独的泵阀单元控制，以使进样液体互相不影响；气路控制层具体包含有下述结构之一或其组合：依次设置在前述四个细胞进样口即细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)上游的控制用的阀：阀七(F)、阀八(G)、阀九(H)、阀十(I)；依次设置在前述四个药物进样口下游的控制用的阀：阀十一(K)、阀十二(L)、阀十三(M)、阀十四(N)；依次设置在前述四个细胞荧光染色进样口即一抗入口(1)、二抗入口(2)、细胞核染料入口(3)、PBS缓冲液入口(4)的下游通道上的控制用的阀：阀一(A)、阀二(B)、阀三(C)、阀四(D)；所述微流控芯片的所有控制用的阀均为常闭阀；

其四，细胞培养室设置有四个：细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)，与之对应的在细胞进样通道区(P2)上游的细胞进样口和下游药物进样通道区(P3)的药物进样口也都分别对应有四个；每一条通道上从上游开始依次串接布置有1个细胞进样口、1个细胞培养室、1个药物进样口；

其五，每个细胞培养室由单独的细胞培养液入口、药物入口、荧光染色液入口、进样通道组成；

其六，至少两个并联的细胞培养室组成液路层；

其七，所述上层芯片和下层芯片的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，上层芯片厚1～5mm，下层芯片厚100～500μm；

其八，所述细胞培养室的尺寸为15mm×2mm×100μm的长梭形；

其九，所述芯片的气路和液路通道高度相同，均为80～200μm；

其十，所述芯片的气路和液路通道宽度不同，气路通道宽度为100～300μm，液路通道宽200～600μm；

其十一，所述液路层为模块；气路层是在制作成功的气路模板上甩一层高于模板10～50μm的聚二甲基硅氧烷膜，所述液路层的聚二甲基硅氧烷模板有结构一侧封接到气路层聚二甲基硅氧烷膜无结构一侧，气路层聚二甲基硅氧烷膜有阀结构一侧等离子键合到洁净的玻璃片上；

所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法相关步骤依次要求如下：

①从四个并联的药物进样口即药物进样口一(9)、药物进样口二(10)、药物进样口三(11)、药物进样口四(12)分别吸出药物溶液，从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)分别加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；

②从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；

③从四个并联的药物进样口即药物进样口一(9)、药物进样口二(10)、药物进样口三(11)、药物进样口四(12)分别吸去多聚甲醛，从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)分别加入磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；

④从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)加入表面活性剂Triton X-100覆盖细胞10min，磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；

⑤从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)加入用血清封闭细胞30min；

⑥在抗体加入之前，打开阀七(F)、阀八(G)、阀九(H)、阀十(I)和阀十一(K)、阀十二(L)、阀十三(M)、阀十四(N)；

⑦打开阀一A，将骨桥蛋白一抗从一抗入口(1)流经荧光染色进样通道区(P1)加入细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)，孵育过夜；关闭阀一(A)，打开阀四(D)，从磷酸缓冲液缓冲液入口(4)加入磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；

⑧次日，关闭阀四(D)，打开阀二(B)，将二抗从二抗入口(2)流经荧光染色进样通道区(P1)加入细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)，避光孵育0.5-3h；关闭阀二(B)，打开阀四(D)，从磷酸缓冲液缓冲液入口(4)加入磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；

⑨关闭阀四(D)，打开阀三(C)，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚从细胞核染料入口(3)流经荧光染色进样通道区(P1)加入细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)，关闭阀三(C)，打开阀四(D)，从缓冲液入口(4)加入磷酸缓冲液清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达。